精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件

DNA復(fù)制DNA復(fù)制1復(fù)制概況復(fù)制體系復(fù)制的起始、延伸與終止其他原核生物的復(fù)制體系其他形式的復(fù)制真核生物的復(fù)制過程DNA復(fù)制本講內(nèi)容提綱復(fù)制概況DNA復(fù)制本講內(nèi)容提綱21DNA復(fù)制的基本機(jī)理－半保留復(fù)制2DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和方式3DNA聚合酶和DNA聚合反應(yīng)4復(fù)制的基本過程5DNA復(fù)制的半不連續(xù)性第一組：復(fù)制概況1DNA復(fù)制的基本機(jī)理－半保留復(fù)制第一組：復(fù)制概況3

1、DNA復(fù)制的基本機(jī)理－半保留復(fù)制半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一條鏈作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一條親代DNA鏈。1、DNA復(fù)制的基本機(jī)理－半保留復(fù)制4全保留復(fù)制半保留復(fù)制混合復(fù)制全保留復(fù)制半保留復(fù)制混合復(fù)制5DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：1958年

Meselson&Stahl

E.coli

放射性同位素（15N）標(biāo)記

CsCl密度梯度離心StahlMeselsonDNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)：StahlMeselson6培養(yǎng)一代培養(yǎng)二代培養(yǎng)三代培養(yǎng)一代培養(yǎng)二代培養(yǎng)三代7親代子一代子二代輕帶重帶混合帶親代子一代子二代輕帶重帶混合帶8DNA半保留復(fù)制的意義：保證DNA代謝的穩(wěn)定性。經(jīng)過多代的復(fù)制，親代的遺傳特征完整無誤的傳遞給子代，子代DNA仍可以保持與最初親本的一致性。

穩(wěn)定性是相對(duì)的，變異是絕對(duì)的在各種理化因素的作用下，DNA會(huì)發(fā)生損傷；在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的過程中，DNA會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤；在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，DNA可能進(jìn)行修飾、刪除、擴(kuò)增和重排。DNA半保留復(fù)制的意義：保證DNA代謝的穩(wěn)定性。在各種理化因92、DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和方式2.1DNA復(fù)制的起點(diǎn)原核生物DNA的復(fù)制是在DNA分子的特定位點(diǎn)開始的，這一位點(diǎn)稱為復(fù)制起點(diǎn)（ori）。原核生物的染色體只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從起點(diǎn)開始，進(jìn)行到終點(diǎn)結(jié)束，完成整個(gè)染色體DNA分子的復(fù)制。2、DNA復(fù)制的起點(diǎn)、方向和方式10復(fù)制子(replicon)或復(fù)制單元：

DNA分子上一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制單位，DNA復(fù)制從起點(diǎn)開始，進(jìn)行到終點(diǎn)結(jié)束。一個(gè)復(fù)制子包括一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)。原核生物單復(fù)制起點(diǎn)，整個(gè)染色體只有一個(gè)復(fù)制子真核生物:多復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)genome中有多個(gè)復(fù)制子。復(fù)制子(replicon)或復(fù)制單元：原核生物單復(fù)制起點(diǎn)，整11復(fù)制起點(diǎn)具有特征性：細(xì)菌、酵母以及葉綠體、線粒體等的DNA復(fù)制起點(diǎn)已經(jīng)被克隆，其核酸序列的共同特點(diǎn)是富含A-T序列。復(fù)制起點(diǎn)具有特征性：122.2DNA復(fù)制的方向：多數(shù)DNA雙向復(fù)制單向進(jìn)行：有些病毒（如腺病毒等）、質(zhì)粒DNA及線粒體DNA。

圖：DNA復(fù)制的方向性復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制叉2.2DNA復(fù)制的方向：多數(shù)DNA雙向復(fù)制圖：DNA復(fù)制的13

復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點(diǎn)。

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛。復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與14

復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制叉

親代鏈

子代鏈

復(fù)制叉復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制叉親代鏈子代鏈復(fù)15真核生物DNA分子復(fù)制具有多個(gè)復(fù)制子，多個(gè)復(fù)制眼真核生物DNA分子復(fù)制具有多個(gè)復(fù)制子，多個(gè)復(fù)制眼16精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件172.3DNA復(fù)制的方式雙向等速復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)DNA。不等速復(fù)制：如枯草桿菌。對(duì)稱復(fù)制：大多數(shù)生物體內(nèi)的DNA的兩條鏈同時(shí)復(fù)制。不對(duì)稱復(fù)制：在一定時(shí)期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況。如線粒體的D-環(huán)復(fù)制和噬菌體的滾環(huán)復(fù)制方式。2.3DNA復(fù)制的方式183DNA聚合酶和DNA聚合反應(yīng)

DNA的復(fù)制是由DNA聚合酶負(fù)責(zé)完成的，按照模板催化合成新DNA鏈。Poly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH

＋2Pi3DNA聚合酶和DNA聚合反應(yīng)DNA的復(fù)制是由DN194DNA復(fù)制的半不連續(xù)性DNA在復(fù)制時(shí)如何同時(shí)作為模板合成其互補(bǔ)鏈?4DNA復(fù)制的半不連續(xù)性DNA在復(fù)制時(shí)如何同時(shí)作為模板合成20

岡崎片段的大?。涸松餅?000-2000bp，真核生物100bp。前導(dǎo)鏈（leadingstrand）后隨鏈（laggingstrand）岡崎片段（Okazakifragment）復(fù)制叉移動(dòng)的方向半不連續(xù)復(fù)制:岡崎片段的大?。涸松餅?000-2000bp，真核生21DNA聚合酶DNA連接酶螺旋酶單鏈結(jié)合蛋白DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶第二組：復(fù)制體系DNA聚合酶第二組：復(fù)制體系22

1DNA聚合酶

DNA的復(fù)制是由DNA聚合酶負(fù)責(zé)完成的，按照模板催化合成新DNA鏈。1DNA聚合酶DNA的復(fù)制是由DNA聚合酶負(fù)責(zé)完23共同性質(zhì):[1]以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為原料;[2]需要模板;[3]不能起始合成新的DNA鏈,需要引物;[4]合成方向5‘→3’。DNA聚合酶（DNApolymerase）共同性質(zhì):DNA聚合酶（DNApolymerase）24

1DNA聚合酶1.1大腸桿菌的DNA聚合酶1.2DNA聚合酶和復(fù)制的忠實(shí)性1.3其它生物的聚合酶1.4DNA聚合酶的引物1DNA聚合酶1.1大腸桿菌的DNA聚合酶251.1大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ:主要參與損傷DNA的修復(fù)，同時(shí)在半保留復(fù)制中有輔助作用，DNA聚合酶II：主要參與DNA修復(fù)，DNA聚合酶III：DNA合成的主要復(fù)制酶。1.1大腸桿菌的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ:主要參與損傷261.1.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ1956年，ArthurKornberg(1)理化性質(zhì)：一條多肽鏈，103KD。含一個(gè)Zn2+400個(gè)分子/細(xì)胞，37℃催化約1000bp/min,1.1.1大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(1)理化性質(zhì)：27（2）功能特點(diǎn)1）5’→3’聚合功能

2）3’→5’外切活性

3）5’→3’外切活性

4）5’→3’內(nèi)切酶活性（2）功能特點(diǎn)1）5’→3’聚合功能28精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件29切口移位反應(yīng)切口移位反應(yīng)30缺口平移標(biāo)記DNA探針缺口平移標(biāo)記DNA探針31枯草桿菌蛋白酶處理后，成兩個(gè)片段，大片段68KD，稱為Klenow片段。枯草桿菌蛋白酶處理后，成兩個(gè)片段，大片段68KD，稱為Kle32

1.1.2大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：(1)理化性質(zhì)：120KD，100個(gè)酶分子/細(xì)胞，活性只有DNApolⅠ的5%。1.1.2大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：33（2）功能特點(diǎn)：5′→3′聚合活性3′→5′外切活性，沒有5′→3′外切活性不是復(fù)制的主要聚合酶,與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。（2）功能特點(diǎn)：34精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件351.1.3大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)

理化性質(zhì)：10-20個(gè)酶分子/細(xì)胞?；钚允荄NApolI的15倍,polII300倍。聚合反應(yīng)需要ATP的存在。反應(yīng)有很高的速度和高度的進(jìn)行性。進(jìn)行性：聚合酶結(jié)合于單鏈模板不解離的能力。1.1.3大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)理化36DNApolⅢ全酶有十種共18個(gè)亞基（2）結(jié)構(gòu)組成和功能特點(diǎn)βDNApolⅢ全酶有十種共18個(gè)亞基（2）結(jié)構(gòu)組成和功37DNA聚合酶Ⅲ含有以下4個(gè)不同的功能組分：1）核心聚合酶:

由α、ε、θ三種亞基組成。功能：α亞基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。ε亞基具有3’-5’外切核酸酶的校對(duì)功能，θ亞基促進(jìn)ε亞基的作用。DNA聚合酶Ⅲ含有以下4個(gè)不同的功能組分：382）β二聚體

β亞基以二聚體、環(huán)狀的形式環(huán)繞著DNA并在DNA自由滑動(dòng)，構(gòu)成一個(gè)滑動(dòng)鉗。功能：滑動(dòng)鉗把全酶束縛在模板DNA上，保證高度的進(jìn)行性。2）β二聚體393）γ復(fù)合物含有5種亞基：γ2δ1δ’1χ1ψ1。功能:γ復(fù)合物是β滑動(dòng)鉗的載體，幫助β滑動(dòng)鉗結(jié)合到DNA上。γ復(fù)合物有依賴DNA的ATP酶活性。β二聚體自己并不能組裝到DNA上，通過γ復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的。3）γ復(fù)合物404）τ二聚體功能：τ2將兩個(gè)核心酶分子和一個(gè)γ復(fù)合物連接起來。

τ亞基是一個(gè)依賴于DNA的ATP酶。4）τ二聚體41精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件42

表

E.coli中的三種DNA多聚酶

DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ結(jié)構(gòu)分子量

103KD120KD850KD構(gòu)成

單體單體異多聚體分子數(shù)/細(xì)胞

40010010-20功能5→3’聚合酶

+++（新生鏈合成）3`→5’外切酶

+++5`→3’外切酶

+－－

1生物學(xué)活性核苷酸數(shù)／min100050約50,0000.0515表E.coli中的三種DNA多聚酶

D431.2DNA聚合酶和復(fù)制的忠實(shí)性復(fù)制過程的忠實(shí)性是保證生物體遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的一個(gè)必要條件，它取決于堿基配對(duì)的專一性。DNA聚合酶可以通過以下方式提高互補(bǔ)堿基選擇的專一性。1.2DNA聚合酶和復(fù)制的忠實(shí)性441）堿基配對(duì)原則維持DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性：2）DNA聚合酶本身的校對(duì)作用

DNApol的3’5’外切酶活性可切除錯(cuò)配堿基，使得DNA復(fù)制錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)只有10-8-10-10。3)需要RNA引物起始DNA復(fù)制，DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

堿基配對(duì)協(xié)同性使得最初幾個(gè)堿基錯(cuò)配率高，而RNA引物最終被降解而避免錯(cuò)誤。4）后隨鏈的不連續(xù)合成因其有利于錯(cuò)配堿基的校正1）堿基配對(duì)原則維持DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性：451.3其他生物的聚合酶噬菌體也編碼DNA聚合酶，它們是T4、T5、T7、SPIO1。這些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。

真核生物中發(fā)現(xiàn)了5種不同的DNA聚合酶，分別為α、β、γ、δ、ε。前四個(gè)位于細(xì)胞核中，而γ是線粒體酶。1.3其他生物的聚合酶461.4DNA聚合酶的引物(primer)DNA復(fù)制為什么需要引物？DNA聚合酶只能催化dNTP到已有核酸鏈的游離3’-OH上，而不能從游離核苷酸起始DNA鏈的合成。DNA聚合酶需要引物來提供3’-OH末端，然后在其上加入核苷酸來延伸DNA鏈。1.4DNA聚合酶的引物(primer)47DNA復(fù)制需要合成引物通常細(xì)胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通過DNA聚合酶延伸RNA鏈的3’-OH。為什么需要一段RNA序列作為引物來進(jìn)行DNA復(fù)制呢?

這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)制需要合成引物通常細(xì)胞先在模板上合成一段RNA序列，48引物合成1）大部分生物利用模板上合成一段RNA序列作為引物；2）環(huán)狀DNA在內(nèi)部形成一個(gè)缺口產(chǎn)生引物末端，如滾環(huán)復(fù)制3）直接引發(fā)合成，特殊蛋白質(zhì)把核苷酸直接引入到聚合酶的催化位點(diǎn)。如腺病毒。引物合成492DNA連接酶（DNALigase）1967年，世界上數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)該酶。

2.1基本性質(zhì)：能將兩段DNA拼接起來的酶，催化DNA相鄰的5‘磷酸基團(tuán)和3’羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉DNA單鏈缺口。2DNA連接酶（DNALigase）1967年，50

1）E＋ATP→E－AMP＋ppi（動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體）

E＋NAD→E－AMP＋NMN（E.coli等細(xì)菌）2）E-AMP上的AMP轉(zhuǎn)移到DNA的5’-PO4上使其活化3）活化的5’-PO4與相鄰的3’-OH作用形成3’－5’

磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。2.2功能特點(diǎn)：2.2功能特點(diǎn)：51精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件523解旋酶(helicase)功能特點(diǎn)：解旋酶可以促使DNA在復(fù)制叉處打開雙鏈，解開氫鍵，形成單鏈。利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵二聚體或六聚體形式存在3解旋酶(helicase)功能特點(diǎn)：53精編課件高中生物競(jìng)賽《DNA復(fù)制》輔導(dǎo)課件544

單鏈結(jié)合蛋白（SSBP）功能特點(diǎn)：在E.coli中以四聚體存在177個(gè)aa組成74KDaSSBP與螺旋酶不一樣，不具備酶的活性，不和ATP結(jié)合。