蛋白酶知識點整理

一、蛋白酶的分類、主要用途及作用三、產(chǎn)酶發(fā)酵四、蛋白酶活性測定的方法蛋白酶的分類、主要用途及作用酶：酶是具有生物催化功能的生物大分子。蛋白酶：水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱蛋白酶分類：據(jù)水解多肽的方式分為內(nèi)肽酶和外肽酶據(jù)反響的最適pH值分為酸性，堿性，中性蛋白酶蛋白酶簡介：廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、細(xì)菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。催化蛋白質(zhì)水解的酶種類很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對所作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種蛋白酶只能作用于蛋白質(zhì)分子中肯定的肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。蛋白酶分布廣泛，主要存在于人和動物消化道中，在植物和微生物中含量豐富，由于動植物資源有限，工業(yè)生產(chǎn)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌等微生物發(fā)酵設(shè)備。23一、酸性蛋白酶定義：一、酸性蛋白酶定義：酸性蛋白酶是一種能在酸性環(huán)境下水解蛋白質(zhì)的酶類pH,主要產(chǎn)酶微生物是毛酶和栗疫酶等，-PH這一類蛋白酶中爭論最徹底的是胃蛋白酶。酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，pH3.0pH50℃以上時很不穩(wěn)定，從而限制了酸性蛋白酶的應(yīng)用范圍。根本性質(zhì)根本性質(zhì)酸性蛋白酶的最適PH24應(yīng)用物生殖，降解酵母菌體蛋白等多種功能。ph3.540度，用該酶處理預(yù)處理后的羊毛，含量啤酒生產(chǎn)：能有效阻斷雙乙酰生成，縮短啤酒成熟期。飼料添加劑：提高飼料利用率。二、堿性蛋白酶簡介堿性蛋白酶是由造育的地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得，主要成分為枯草桿菌蛋白酶，是一種內(nèi)切酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為27300。堿性蛋白酶是由造27300。根本性質(zhì)適宜于在40-55℃、PH9-11下降。重金屬離子和陽離子外表活性劑對其活力有抑制作用，應(yīng)用中應(yīng)避免。應(yīng)用堿性蛋白酶是目前市場上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力，特別對血漬、汗?jié)n、奶漬、油漬等蛋白類污垢 ,具有獨特的洗滌效果。二、中性蛋白酶簡介中性蛋白酶是由枯草芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵提取而得的，屬于一種內(nèi)切酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解處理。在肯定溫度、 PH值下，本品能將大分子蛋白質(zhì)水解為氨基酸等產(chǎn)物?？蓮V泛應(yīng)用于動植物蛋白的水解根本性質(zhì)水解溫度35～55℃PH值：6.0～7.5應(yīng)用動植物蛋白水解粉〔HAP、HVP〕生產(chǎn)的應(yīng)用利用中性蛋白酶的酶促反響，可把動植物的大分子蛋白質(zhì)水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白質(zhì)的有效吸取和利用，其水解液 高，風(fēng)味佳，已廣泛用于生產(chǎn)高級調(diào)味品和食品養(yǎng)分強(qiáng)化劑，各種動物來〔骨素〕、水產(chǎn)提取物、蛋白胨、肽等及爭論開發(fā)一些高附加值的功能食品。焙烤行業(yè)的應(yīng)用：面團(tuán)筋力，使它具有良好的可塑性和延長性，保持清楚美觀的印花圖案。改善成品的光澤、使餅干斷面層次清楚，構(gòu)造均勻全都，口感松爽酥脆。大豆分別蛋白的應(yīng)用：價，使其易為人體消化吸取，同時還提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分別蛋白的功能特性。酵母抽提物、酵母浸膏的生產(chǎn)應(yīng)用55添加中性蛋白酶分解蛋白質(zhì)為多肽和游離氨基氮，特別對大麥，大豆等植物性蛋白作用效果明顯，用于啤酒生產(chǎn)，可排解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的“現(xiàn)象。6“冷混濁含中性蛋白酶的藥物，可起到消炎、利膽、止痛、助消化的成效。紡織工業(yè)的應(yīng)用：收縮性為0；還可用于蠶的脫膠和蠶絲的精煉。皮革工業(yè)的應(yīng)用：無明顯損傷，毛孔細(xì)致光亮。飼料工業(yè)的應(yīng)用：和降低飼養(yǎng)本錢。產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選方法一〔形成芽孢產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選〕枯草桿菌是屬于芽孢桿菌屬的一類細(xì)菌。枯草芽孢桿菌的分布格外廣BF7658枯草芽孢桿菌生產(chǎn)а-AS1398枯草桿菌是生產(chǎn)蛋白酶的重要菌株。枯草芽孢桿菌的芽孢耐熱的特點。高溫加熱殺死其中不生芽孢的菌種，使耐熱的芽孢菌得到富集。枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶特征。(H)和菌落直徑(C)之比值(H/C)可以初步確定酶活力，其比值越大，酶活力越高，進(jìn)而可篩選出高產(chǎn)酶活的菌株?？莶菅堪麠U菌的形態(tài)特征0.7×2～3μm，養(yǎng)分細(xì)胞為桿狀，桿端鈍圓、單生或者短鏈，著色均勻，無莢膜，周邊運(yùn)動，革蘭氏染色陽性。有芽孢0.6×1～1.5μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈橢圓或長筒形，常為兩端染色。菌落變化很大，枯草芽孢桿菌在麥芽汁瓊脂培育基斜扁平、擴(kuò)展，不透亮，不閃光，外表枯燥，污白色或微帶黃色?？莶菅堪麠U菌的生理生化特性25～31℃生長。二、試驗材料及用具12115min。.100ml20mL250mL錐形瓶中〔10顆〕；50mL固體斜面培育基分裝在試管中：5mL/支，10支。〔2〕酪素培育基：1g，5g，0．1g，L-0．1g，20min，倒好平板后進(jìn)展無菌檢查。生理鹽水：0.85%NaCl水溶液，9mL/支×10支其他102〔250mL，500mL規(guī)格〕、革蘭氏染色液等。三、試驗步驟采樣從地表下10~15cm取土樣。增殖培育〔富集培育〕取土樣平攤于一干凈的紙上，從四個角和中心各取一點土，混勻，稱取1g，肉湯培育基250ml80℃水30℃，15024h。取樣鏡檢形成芽孢的狀況。涂布分別細(xì)胞，以濃縮芽孢桿菌〔1ml培育液經(jīng)適當(dāng)稀釋后作革蘭氏染色，觀看是否有枯草芽孢桿菌存在，本試驗中略去該步驟〕。酪素培育基平板上〔初篩平板，每個稀釋度平均兩皿〕，用滅過菌的涂布棒將菌液均勻涂布在酪素平板上，倒置于30℃培育(H/C)比值大的菌接入斜面培育基，3024h，備用。純化用平板劃線分別法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分別純化選擇出的菌株。純種鑒定菌種經(jīng)革蘭氏染色，油鏡觀看，從細(xì)胞形態(tài)及菌落特征進(jìn)展鑒別。①細(xì)胞形態(tài)，菌落特征，芽孢形成狀況。②產(chǎn)蛋白酶力量的測定：直接觀看在酪素平板上菌落四周所形成的透亮圈。菌種保藏 該試驗分別得到的枯草芽孢桿菌作為后續(xù)試驗的菌種使方法二〔利用蛋白水解圈〕—試驗原理通過樣品采集、富集培育、濃度稀釋、涂布培育、傳代培育和鑒定來分別產(chǎn)蛋白用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸與Folin檢驗時將福林試細(xì)菌產(chǎn)生了蛋白酶。說明在這種培育基長出的菌落是所接中的細(xì)菌生長的.圈。水解圈與菌落直徑的比值常被作為推斷該菌株蛋白酶產(chǎn)生力量的初篩依據(jù)。高產(chǎn)菌株。二、試驗器材菌株從自然界篩選獲得的蛋白酶產(chǎn)生菌株溶液和試劑g，瓊脂，酪素，蒸餾水等3高壓滅菌鍋。4.培育基：酪素培育基〔液體和固體平板〕三、操作步驟取少量土樣混于無菌水中，用酪素液體培育基進(jìn)展富集培育基。3724h建議用地衣芽孢桿菌作為比照菌株5后轉(zhuǎn)接到肉湯瓊脂斜面上，3724h，獲得菌種，并對其理化性質(zhì)進(jìn)展鑒定。產(chǎn)酶發(fā)酵9參考書：酶工程〔其次版〕郭勇參考書：酶工程〔其次版〕郭勇科學(xué)出版社蛋白酶活性測定的方法一、原理混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物復(fù)原而呈藍(lán)〔鎢蘭和鎢蘭混合物〕。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸〔酪氨酸、〕，因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反響。利用蛋白酶分解酪素〔底物〕生成含酚基氨基酸的呈色反響，來間接測定蛋白酶的活力。二、儀器和設(shè)備和試劑1.儀器和設(shè)備0.0001g；〔2〕恒溫水浴：精度±0.2℃；〔3〕計時表；〔4〕分光光度計；〔5〕沸水浴器；〔6〕振蕩混合器2.試劑和溶液乳酸緩沖液〔pH=3.0〕適用于酸性蛋白酶1000ml。乙液：稱取乳酸鈉〔70%〕16g,1000ml.0.05mol/L酸緩沖溶液。磷酸緩沖液的制備〔pH=7.5〕適用于中性蛋白酶〔NaHPO.12H〔NaHPO.2HO〕2 3 20.5g,1000ml

2 3 211硼酸緩沖液(pH=10.5)1000ml。1000ml.500ml,400ml,1L?！?〕0.4mol/L：準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4g,以蒸餾水溶解定溶至1000ml.〔5〕0.4mol/L：65.4g1000ml〔6〕0.5mol/LNaOH：2gNaOH100ml10.00mg/ml0.5mol/L為酸性蛋白酶則用濃乳酸2-3滴)潤濕,,參加適量的各適宜的緩沖液約80ml,100ml瓶中,用適宜的緩沖液稀釋至刻度,此溶液在冰箱內(nèi)貯存,有效期為三天.100μg/mlL-0.1000g1mol/L60ml100ml,1.00mg/ml10.00ml,0.1mol/L100ml,100.0μg/mlL-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.酶樣的制備100ml100福林試劑1ml50g〔NWO2HO)，125ga 4` 2aO4` 2500ml，過濾，置于棕色瓶中暗處保4三、步驟12標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按下表配制。01012345012345109876501020304050取100μg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液〔ml〕蒸餾水〔ml〕酪氨酸實際濃度〔μg/ml〕0.4mol/L〔作用？〕1.00ml,40+0.2℃20min,取出用分680nm0算回歸方程。計算出當(dāng)OD1〔μg〕，即為吸光常數(shù)KK95~100樣品測定：先將酪素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min；41ml31ml40℃10min；取出試管，3支測試管中各參加2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素；10min，過濾沉淀；1ml0.4mol/LNaC