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文檔簡介
實(shí)驗(yàn)一生化實(shí)驗(yàn)基本操作
臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)一生化實(shí)驗(yàn)基本操作臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)教1生物化學(xué)基本技術(shù)及應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)常識(shí)(一)、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及安全及防護(hù)知識(shí)1.自覺地遵守課堂紀(jì)律,維護(hù)課堂秩序,保持室內(nèi)安靜。必須穿白大褂,不能穿背心、拖鞋進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。生物化學(xué)基本技術(shù)及應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)常識(shí)22.要認(rèn)真、嚴(yán)肅、積極、主動(dòng)地做實(shí)驗(yàn),要聽從教師的指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)過程中要認(rèn)真做好觀察、記錄。完成實(shí)驗(yàn)后經(jīng)教師檢查同意,方可離開。實(shí)驗(yàn)完成后要及時(shí)的按要求完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。2.要認(rèn)真、嚴(yán)肅、積極、主動(dòng)地做實(shí)驗(yàn),要聽從教師的指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)33.注意保持實(shí)驗(yàn)室的整潔。實(shí)驗(yàn)完畢,須將藥品試劑排列整齊,儀器要放好,將實(shí)驗(yàn)臺(tái)面抹拭干凈。使用后的玻璃儀器要清洗干凈放好。3.注意保持實(shí)驗(yàn)室的整潔。實(shí)驗(yàn)完畢,須將藥品試劑排列整齊,儀44.要愛護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器,節(jié)約使用各種試劑、物品。使用儀器時(shí),應(yīng)小心仔細(xì),防止損壞儀器。使用貴重精密儀器時(shí),應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程,發(fā)現(xiàn)故障立即報(bào)告教師,不要自己動(dòng)手檢修。儀器損壞時(shí),應(yīng)如實(shí)向教師報(bào)告。4.要愛護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器,節(jié)約使用各種試劑、物品。使用儀器時(shí),應(yīng)小55.廢棄液體(強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋)可倒入水槽內(nèi),同時(shí)放水沖走。廢紙及其他固體廢物和帶有渣滓沉淀的廢液都應(yīng)倒入指定的垃圾筐內(nèi),不得倒入水槽或到處亂扔。5.廢棄液體(強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋)可倒入水槽內(nèi),同時(shí)66.對(duì)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和安排不合理的地方可提出改進(jìn)意見。對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的一切反?,F(xiàn)象應(yīng)進(jìn)行討論,并大膽提出自己的看法,做到生動(dòng)、活潑、主動(dòng)地學(xué)習(xí)。6.對(duì)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和安排不合理的地方可提出改進(jìn)意見。對(duì)實(shí)驗(yàn)中出77.使用電器設(shè)備(如恒溫水浴、離心機(jī)、電爐等)時(shí),嚴(yán)防觸電;絕不可用濕手或在眼睛旁視時(shí)開關(guān)電閘和電器開關(guān)。檢查電器設(shè)備是否漏電應(yīng)用試電筆或手背觸及儀器表面。凡是漏電的儀器一律不能使用。7.使用電器設(shè)備(如恒溫水浴、離心機(jī)、電爐等)時(shí),嚴(yán)防觸電;88.可燃物,特別是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯等)時(shí),應(yīng)特別小心。不要大量放在桌上,更不應(yīng)放在近火焰處。低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑不準(zhǔn)在火焰上直接加熱,只能在水浴上利用回流冷凝管加熱或蒸餾。8.可燃物,特別是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯等)時(shí),應(yīng)特99.使用濃酸、濃堿,必須極為小心地操作,防止濺失。用吸量管取這些試劑時(shí),必須使用橡皮球,絕對(duì)不能用口吸。若不慎濺在實(shí)驗(yàn)臺(tái)或地面,必須及時(shí)用濕抹布擦洗干凈。如果觸及皮膚,應(yīng)立即治療。9.使用濃酸、濃堿,必須極為小心地操作,防止濺失。用吸量管取1010.如果不慎傾出了相當(dāng)量的易燃液體,則應(yīng)按下法處理:(1)立即關(guān)閉室內(nèi)所有的火源和電加熱器。(2)關(guān)門,開啟小窗及窗戶。(3)用毛巾或抹布擦拭灑出的液體,并將液體擰到大的容器中,然后再倒入帶塞的玻璃瓶。10.如果不慎傾出了相當(dāng)量的易燃液體,則應(yīng)按下法處理:(1)1111.實(shí)驗(yàn)中一旦發(fā)生火災(zāi)切不可驚慌失措,應(yīng)保持鎮(zhèn)靜。首先立即切斷室內(nèi)一切火源和電源。然后根據(jù)具體情況積極正確地進(jìn)行搶救和滅火。11.實(shí)驗(yàn)中一旦發(fā)生火災(zāi)切不可驚慌失措,應(yīng)保持鎮(zhèn)靜。首先立即12(二)、實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果和數(shù)據(jù),應(yīng)及時(shí)地直接記在記錄本上。原始記錄必須準(zhǔn)確、簡練、詳盡、清楚。記錄時(shí),應(yīng)做到如實(shí)正確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不可夾雜主觀因素。在定量實(shí)驗(yàn)中觀測的數(shù)據(jù),如稱量物的質(zhì)量、滴定管的讀數(shù)、光度計(jì)的讀數(shù)等,都應(yīng)設(shè)計(jì)表格準(zhǔn)確記下讀數(shù),并根據(jù)儀器的精確度準(zhǔn)確記錄有效數(shù)字。(二)、實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告13實(shí)驗(yàn)中使用儀器的類型、編號(hào)及試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、準(zhǔn)確的濃度等,也應(yīng)如實(shí)記錄,以便在總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對(duì)和作為查找成敗原因的參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中使用儀器的類型、編號(hào)及試劑的規(guī)格、化學(xué)式、分子量、準(zhǔn)14如果發(fā)現(xiàn)記錄的結(jié)果有可疑、遺漏、丟失等,都必須重做實(shí)驗(yàn)。因?yàn)?,將不可靠的結(jié)果當(dāng)做正確的記錄,在實(shí)際工作中可能造成難以估計(jì)的損失。所以,在學(xué)習(xí)期間就應(yīng)一絲不茍,努力培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)作風(fēng)。如果發(fā)現(xiàn)記錄的結(jié)果有可疑、遺漏、丟失等,都必須重做實(shí)驗(yàn)。因152.實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。下面列舉實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫格式,僅供參考。2.實(shí)驗(yàn)報(bào)告16實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求:實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)日期、目的和要求、原理、實(shí)驗(yàn)測定的數(shù)據(jù)、圖紙及結(jié)果、結(jié)果分析和討論。實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫要求:實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)日期、目的和要求、原理、實(shí)驗(yàn)17原理:實(shí)驗(yàn)原理簡要?dú)w納,一些可用化學(xué)反應(yīng)式表示。數(shù)據(jù)、圖紙及結(jié)果:將一定實(shí)驗(yàn)條件下獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析和對(duì)比,并盡量總結(jié)成各種圖表,如原始數(shù)據(jù)及其處理的表格、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖以及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較圖表等。原理:實(shí)驗(yàn)原理簡要?dú)w納,一些可用化學(xué)反應(yīng)式表示。18結(jié)果分析和討論:討論部分不是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述,而是關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法(或操作技術(shù))和有關(guān)實(shí)驗(yàn)的一些問題,如對(duì)實(shí)驗(yàn)的正常結(jié)果和異?,F(xiàn)象以及思考題進(jìn)行探討;對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議;對(duì)實(shí)驗(yàn)課的改進(jìn)意見等。結(jié)果分析和討論:討論部分不是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述,而是關(guān)于實(shí)驗(yàn)方191.新購置玻璃儀器的清洗新購買的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì),可先用肥皂水(或去污粉)洗刷,再用自來水洗凈,然后浸泡在l%~2%鹽酸溶液中過夜(不少于4h),再用自來水沖洗,最后用蒸餾水沖洗2~3次,在烘箱內(nèi)。1.新購置玻璃儀器的清洗新購買的玻璃儀器表面常附著有游離202.使用過的玻璃儀器的清洗(1)一般玻璃儀器:如試管、燒杯、錐形瓶等、,先用自來水沖洗至無污物,再選用大小合適的毛刷沾取去洗衣粉或肥皂水,將器皿內(nèi)外(特別是內(nèi)壁)細(xì)心刷洗,再用自來水沖洗干凈,洗至容器內(nèi)壁光潔不掛水珠為止,最后用蒸餾水沖洗2~3次,倒置在清潔處晾干,急用時(shí)可用干燥箱烤干。2.使用過的玻璃儀器的清洗21(2)容量儀器:如吸量管、滴定管、量瓶等,使用后應(yīng)立即浸泡于涼水中,勿使物質(zhì)干涸。工作完畢后用流水沖洗,以除去附著的試劑、蛋白質(zhì)等物質(zhì),晾干后浸泡在鉻酸洗液中4~6h(或過夜),再用自來水反復(fù)沖洗干凈,最后用蒸餾水沖洗2~3次,晾干備用。(2)容量儀器:如吸量管、滴定管、量瓶等,使用后應(yīng)立即浸泡于22(3)其他:盛裝具有傳染性樣品的容器,如病毒、傳染病患者的血清等沾污過的容器,應(yīng)先進(jìn)行高壓(或其他方法)消毒后再進(jìn)行清洗。盛過各種毒品,特別是劇毒藥品和放射性同位素物質(zhì)的容器,必須經(jīng)過專門處理(略),確知沒有殘余毒物存在方可進(jìn)行清洗。(3)其他:盛裝具有傳染性樣品的容器,如病毒、傳染病患者的血23四、實(shí)驗(yàn)室基本操作和常識(shí)(一)玻璃儀器的清洗玻璃儀器是生物化學(xué)中不可缺少的器具。實(shí)驗(yàn)中所使用的玻璃儀器清潔與否,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,往往由于儀器的不清潔或被污染而造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差,甚至?xí)霈F(xiàn)相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,玻璃儀器的洗滌清潔工作是非常重要的。四、實(shí)驗(yàn)室基本操作和常識(shí)(一)玻璃儀器的清洗24(二)吸量管的使用吸量管(簡稱吸管)是生化實(shí)驗(yàn)中最常用的儀器,可分為三類:①奧氏吸管,②移液管,③刻度吸管。(二)吸量管的使用吸量管(簡稱吸管)是生化實(shí)驗(yàn)中最常用的儀25刻度吸管的使用:(1)選擇:使用前先根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)奈抗?,刻度吸管的總量最好等于或稍大于最大取液量。臨用前要看清容量和刻度??潭任艿氖褂茫?6(2)執(zhí)管:用右手拇指和中指(輔以無名指),拿住吸管的上部,用食指堵住管上口和控制液流,刻度數(shù)字要對(duì)向自己。切忌用大拇指堵住管口,控制流量。(2)執(zhí)管:用右手拇指和中指(輔以無名指),拿住吸管的上部,27(3)取液:另一左手捏壓吸耳球,將吸管插入所量取的試劑溶液中,用吸耳球下端出口對(duì)準(zhǔn)吸管的上口,將液體輕輕吸上至所需取量刻度上端稍高處,立即用右手食指堵住管口。(3)取液:另一左手捏壓吸耳球,將吸管插入所量取的試劑溶液中28(4)調(diào)準(zhǔn)刻度:將吸管從溶液中取出,吸管輕輕刮于試劑瓶口,如液體粘性大,可用濾紙擦干管尖外壁,然后用食指控制流量,使液體緩慢下降至所需刻度(注意液體凹面與視線和刻度應(yīng)在同一平面,此時(shí)立即壓緊吸管上口,使液體不再流出)。(4)調(diào)準(zhǔn)刻度:將吸管從溶液中取出,吸管輕輕刮于試劑瓶口,如29(5)放液:放松食指,讓液體自然流入試管內(nèi),管尖不要插入試管下部原有的溶液中,以免污染吸管和試劑,當(dāng)液體流出完后,讓吸管尖端??咳萜鲀?nèi)壁3-5秒鐘??潭任抗芪醋⒚鞔档牟荒艽党鰵堃?。(5)放液:放松食指,讓液體自然流入試管內(nèi),管尖不要插入試管30(6)洗滌:用過的吸管要另放好,不能跟干凈的吸管同放,混淆不清,待做完實(shí)驗(yàn)后要清洗。(6)洗滌:用過的吸管要另放好,不能跟干凈的吸管同放,混淆不31(三)溶液的混勻樣品與試劑的混勻是保證化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行地一種有效措施。為使反應(yīng)體系內(nèi)各物質(zhì)迅速地相互接觸,必須借助于外加的機(jī)械作用?;靹驎r(shí)須防止容器內(nèi)液體濺出或被污染。嚴(yán)禁用手指直接堵塞試管口或錐形瓶口振搖?;靹虻氖址ㄓ幸韵聨追N,可隨使用的器皿和液體容量而選擇。(三)溶液的混勻樣品與試劑的混勻是保證化學(xué)反應(yīng)充分進(jìn)行地一種321.玻棒攪動(dòng)法適用于燒杯內(nèi)容物的混勻,如固體試劑的溶解和混勻。2.吸量管混勻法用吸管將溶液反復(fù)吸放數(shù)次,使溶液充分混勻。1.玻棒攪動(dòng)法適用于燒杯內(nèi)容物的混勻,如固體試劑的溶解和333.倒轉(zhuǎn)混勻法適用于有塞量筒和容量瓶、試管內(nèi)容物的混勻。一般試管內(nèi)容物的混勻可用聚乙烯等薄膜封口,再用手按住管口倒轉(zhuǎn)混勻。3.倒轉(zhuǎn)混勻法適用于有塞量筒和容量瓶、試管內(nèi)容物的混勻。344.指彈混勻法左手持試管上端多用右手指輕輕彈動(dòng)試管下部,使管內(nèi)溶液作旋渦運(yùn)動(dòng)。5.旋轉(zhuǎn)混勻法用手持容器,使溶液作離心旋轉(zhuǎn),適用于未盛滿液體的試管或小口器皿,如錐形瓶。旋轉(zhuǎn)試管時(shí)最好用手腕旋轉(zhuǎn)。4.指彈混勻法左手持試管上端多用右手指輕輕彈動(dòng)試管下部,356.甩動(dòng)棍勻法右手持試管上部輕輕甩動(dòng)振搖,即可混勻。7.電磁攪拌混勻法在電磁攪拌機(jī)上放置燒杯夢(mèng)在燒杯內(nèi)放入封閉于玻璃或塑料管中的小鐵棒,利用磁力使小鐵棒旋轉(zhuǎn)以達(dá)到混勻杯中液體的目的。適用于酸堿自動(dòng)滴定,pH梯度滴定等。6.甩動(dòng)棍勻法右手持試管上部輕輕甩動(dòng)振搖,即可混勻。368.振蕩器混勻法利用振蕩器使容器中的內(nèi)容物振蕩,達(dá)到混勻的目的。8.振蕩器混勻法利用振蕩器使容器中的內(nèi)容物振蕩,達(dá)到混37二、基本技術(shù)及應(yīng)用(一)分光光度法技術(shù)二、基本技術(shù)及應(yīng)用(一)分光光度法技術(shù)38物質(zhì)對(duì)光線有選擇性的吸收作用。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同,對(duì)不同波長光線的吸收能力也不同。因此,每種物質(zhì)都具有其特異吸收光譜。根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性或定量分析的方法稱為吸收光譜法,或分光光度法。該法所用的儀器稱為分光光度計(jì)或吸收光譜儀。物質(zhì)對(duì)光線有選擇性的吸收作用。不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同,對(duì)39分光光度法具有操作簡便,快速等特點(diǎn),它是生物化學(xué)分析的重要手段之一,也是其他學(xué)科進(jìn)行分析研究的重要手段之一,對(duì)醫(yī)學(xué)生來說是一項(xiàng)重要的操作技術(shù)。分光光度法具有操作簡便,快速等特點(diǎn),它是生物化學(xué)分析的重要手40原理分光光度法作為定量分析的基本依據(jù)是Lambert-Beer定律,他們根據(jù)一系列的實(shí)驗(yàn)證明:當(dāng)一束單色光通過溶液介質(zhì)時(shí),部分光能被溶液吸收。吸收的比值(透射光/入射光)和入射光的強(qiáng)度無關(guān),但與介質(zhì)的厚度及介質(zhì)的濃度成正比。原理分光光度法作為定量分析的基本依據(jù)是Lambert-B41A=KCL當(dāng)溶液厚度(L)不變時(shí),對(duì)于不同濃度的同一物質(zhì)和同樣波長的單色光(即消光系數(shù)不變),溶液的吸光度和溶液的濃度成正比:A1/A2=C1/C2→C1=A1×C2/A2A=KCL42式中C2為標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,可根據(jù)測得的吸光度值,按公式(3)求得待測溶液的濃度(C1)。實(shí)際工作中為簡便起見,常常事先測定一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)管,然后以吸光度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,測得待測物質(zhì)的吸光度后,可(從)標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。式中C2為標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,可根據(jù)測得的吸光度值,按公式(3)求43
可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì)44722型分光光度計(jì)的使用:1.接通電源預(yù)熱20分鐘(此時(shí)暗箱蓋應(yīng)打開)。2.轉(zhuǎn)動(dòng)波長選擇扭,選用所需的波長。3.固定靈敏度。(一般使用“靈敏度調(diào)節(jié)旋鈕”1檔,如調(diào)不到“T=100”再選用較高檔,中途不再變動(dòng).)722型分光光度計(jì)的使用:454.調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。揭開比色杯暗箱蓋(光門自動(dòng)關(guān)閉),轉(zhuǎn)動(dòng)“0%T旋鈕”,使數(shù)字顯示為0.00處。5.放置比色杯將盛有溶液的比色杯放置于比色杯架中。4.調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)。揭開比色杯暗箱蓋(光門自動(dòng)關(guān)閉),轉(zhuǎn)動(dòng)“0466.調(diào)節(jié)T=100%。將比色杯放入比色杯架,使空白管對(duì)向光路,蓋好比色杯暗箱蓋,轉(zhuǎn)動(dòng)“100%T旋鈕”。調(diào)準(zhǔn)電表指針指向T=100處。7.測定,讀數(shù)。拉動(dòng)比色杯座的拉桿,使測定杯進(jìn)入光路,迅速從電表上讀出吸光度值,記錄。測定過程中隨時(shí)拉回拉桿到原位,是空白進(jìn)入光路,觀察指針是否在T=100處,如不在及時(shí)調(diào)節(jié)。6.調(diào)節(jié)T=100%。將比色杯放入比色杯架,使空白管對(duì)向光路478.關(guān)機(jī)。關(guān)上電源開關(guān);取出比色杯,檢查比色杯架是否弄濕、弄臟,如比色杯架臟或濕,應(yīng)取出沖洗干凈,擦干后放回原處,然后將暗箱蓋好,清洗比色杯并涼干。8.關(guān)機(jī)。關(guān)上電源開關(guān);取出比色杯,檢查比色杯架是否弄濕、弄48注意事項(xiàng):
1.為了防止光電管疲勞,不測定時(shí)必須將比色槽暗箱蓋打開,使光路切斷,以延長電管使用壽命。2.拿比色杯時(shí),手指只能捏住毛玻璃面、不能碰比色杯的透光面,以免沾污。裝溶液時(shí),液量為比色杯容積的3/4為宜。注意事項(xiàng):1.為了防止光電管疲勞,不測定時(shí)必須將比色槽暗箱493.比色杯外壁的液體用擦鏡紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干,再放入比色槽。不能用吸水紙擦比色杯內(nèi)壁。4.測定有色溶液時(shí),一定要用少量的原液(有色溶液)洗比色杯內(nèi)壁1~2次,以免改變有色溶液的濃度。另外,在測一系列溶液時(shí),通常是按從稀到濃的順序測定,以減少測量誤差。3.比色杯外壁的液體用擦鏡紙或細(xì)而軟的吸水紙吸干,再放入比色505.本型儀器A值在0.2~0.7之間誤差較小,準(zhǔn)確度較高。所以在測定時(shí),可根據(jù)溶液的濃度選用不同厚度的比色杯)但同一實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用同規(guī)格比色杯,中途不能更換),使溶液的吸光度控制在0.2~0.7之間.5.本型儀器A值在0.2~0.7之間誤差較小,準(zhǔn)確度較高。所516.用完比色杯應(yīng)立即用自來水沖洗,再用蒸餾水洗凈。不能用堿性溶液或氧化性很強(qiáng)的洗滌劑,以免損壞,也不能用毛刷洗,以免損傷透光面。6.用完比色杯應(yīng)立即用自來水沖洗,再用蒸餾水洗凈。不能用堿性52
離心技術(shù)基本原理離心技術(shù)是利用微粒繞軸旋轉(zhuǎn)時(shí)借慣性的離心運(yùn)動(dòng),產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力,將混合物中密度不同的各組分分離的方法。離心技術(shù)基本原理53離心力場的大小常用重力來表示,稱為相對(duì)離心力(RCF)。一般情況下,在低速或高速離心時(shí)常用轉(zhuǎn)速n即每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)來表示;超速離心時(shí)常用重力加速度g的倍數(shù)來表示。離心力場的大小常用重力來表示,稱為相對(duì)離心力(RCF)。一54離心機(jī)分類(1)按離心管在離心時(shí)所處的位置不同,
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