薄層色譜及柱色譜課件

薄層色譜及柱色譜指導(dǎo)教師：徐曉層色譜及柱色譜薄層色譜及柱色譜指導(dǎo)教師：徐曉、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握色譜法的基本原理及其應(yīng)用。2、掌握薄層色譜及柱色譜的操作技能。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握色譜法的基本原理及其應(yīng)用。二、色譜法基本原理1.色譜法又稱為層析法，是分離，純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。2.色譜法的基本原理是利用混合物各組分在兩相間（流動(dòng)相和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差異。即當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于固定相對(duì)各組分的吸附或溶解性能的不同，經(jīng)過(guò)兩相間反復(fù)多次的吸附或分配，使吸附較弱或溶解度較小的組分在固定相中移動(dòng)較快，從而使各組分得到分離。3.色譜法的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面：（1）分離混合物（2）精致提純化合物（3）鑒定化合物（4）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程4.兩相中，相對(duì)固定不動(dòng)的一相稱為固定相，移動(dòng)的一相稱為流動(dòng)相。二、色譜法基本原理1.色譜法又稱為層析法，是分離，純化和鑒定三、色譜法的分類（1）薄層色譜：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板上，形成薄層來(lái)進(jìn)行物質(zhì)分離及分析的方法。按其操作不同，可分為薄層色譜、柱色譜、紙色譜、氣相色譜和高效液相色譜。（2）柱色譜：將固定相裝在色譜柱中，使樣品沿著色譜柱移動(dòng)，通過(guò)各組分隨流動(dòng)相流動(dòng)而得到分離的方法。（3）紙色譜：用濾紙等作為液體的載體，將樣品點(diǎn)在紙上隨后展開(kāi)而達(dá)到分離鑒定的方法。（4）氣相色譜：是以氣體為流動(dòng)相的色譜法。三、色譜法的分類（1）薄層色譜：將固定相均勻涂布在表面光滑的三、色譜法的分類（1）吸附色譜：利用吸附劑對(duì)不同組分吸附能力的不同加以分離的方法。（2）分配色譜：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的方法。（3）離子交換色譜：利用離子交換劑與各組分之間的離子親和力不同而進(jìn)行層析分離的方法。按其作用原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。（5）高效液相色譜：是利用液態(tài)的流動(dòng)相在高壓驅(qū)動(dòng)下流經(jīng)填充著固定相的色譜柱時(shí)，加載的樣品得以分離，并利用各組分不同的物理性質(zhì)加以檢測(cè)。（4）凝膠滲透色譜：利用不同組分之間分子大小不同，在通過(guò)凝膠介質(zhì)時(shí)所受到的阻滯作用的差異而進(jìn)行分離的方法。三、色譜法的分類（1）吸附色譜：利用吸附劑對(duì)不同組分吸附能力四、薄層色譜1.薄層板的制備：（1）固定相的選擇：吸附色譜：氧化鋁、硅膠（H——不含黏合劑）分配色譜的支持劑：硅藻土、纖維素（F——含熒光物質(zhì)）（G——含煅石膏2CaSO4·H2O黏合劑)？HF254GF254

薄層板的制備點(diǎn)樣展開(kāi)顯色，計(jì)算、分析四、薄層色譜1.薄層板的制備：薄層板的制備點(diǎn)樣展開(kāi)顯色，計(jì)算四、薄層色譜（2）制板：干法和濕法取3g硅膠G與6-7mL0.5%-1%的羧甲基纖維素鈉的水溶液在燒杯中調(diào)成糊狀物平鋪或浸漬室溫晾干后，放入烘箱內(nèi)加熱活化通常用六中染料確定活性四、薄層色譜（2）制板：取3g硅膠G與6-7mL平鋪室溫晾四、薄層色譜2.點(diǎn)樣（2）通常將樣品溶于低沸點(diǎn)溶劑（丙酮，甲醇、乙醚等），根據(jù)使用的固定相配成0.5%-5%的溶液，用內(nèi)徑小于1mm管口平整的毛細(xì)管，在起始線上小心點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑一般不超過(guò)2-3mm。（1）點(diǎn)樣前，先在薄層板上據(jù)底端1cm處，用尺子、鉛筆輕畫(huà)一橫線作為起始線.（3）同一塊板可點(diǎn)幾個(gè)樣品點(diǎn)，但是間距應(yīng)為1-1.5cm。點(diǎn)樣要輕，不可刺破薄層！毛細(xì)管在薄層上的停留時(shí)間不能太長(zhǎng)，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，影響分離效果。（4）點(diǎn)樣結(jié)束，必須待樣品點(diǎn)干燥后，方可進(jìn)行展開(kāi)。四、薄層色譜2.點(diǎn)樣（2）通常將樣品溶于低沸點(diǎn)溶劑（丙酮，甲四、薄層色譜3.展開(kāi)（2）展開(kāi)操作：a.先在密閉的展開(kāi)槽內(nèi)倒入少量配好的展開(kāi)劑，高度不能超過(guò)1cm。待其蒸氣飽和，以達(dá)到平衡。（約5min）b.將點(diǎn)樣后的薄層板放入展槽中，先不要接觸展開(kāi)劑，讓薄層板吸附蒸氣以達(dá)飽和。（約3min）c.將點(diǎn)樣的一端放入展開(kāi)劑中，墊高薄層板，始終使薄層板浸入展開(kāi)劑為0.5cm，展開(kāi)劑高度絕對(duì)不能浸過(guò)起始線！d.待溶劑前沿離頂端1cm左右，就應(yīng)取出薄層板，待展開(kāi)劑揮干后，觀察分析。絕對(duì)不能使展開(kāi)劑漫過(guò)薄層板的頂端！（1）展開(kāi)劑的選擇：根據(jù)樣品的極性、溶解度和吸附劑的活性等因素考慮。四、薄層色譜3.展開(kāi)（2）展開(kāi)操作：（1）展開(kāi)劑的選擇：根據(jù)四、薄層色譜4.顯色、計(jì)算及分析（1）若樣品本身是有色的，可以直接觀察到分離的過(guò)程及結(jié)果。

若無(wú)色，則可通過(guò)以下幾種方法顯色：碘熏、紫外光燈、噴顯色劑。（2）計(jì)算比移值（Rf）：四、薄層色譜4.顯色、計(jì)算及分析（1）若樣品本身是有色的，可四、薄層色譜（3）良好的分離，Rf值應(yīng)在0.15-0.75之間，否則應(yīng)更換展開(kāi)劑重做。通常樣品的極性越大，Rf值越小。（4）在一定的操作條件下，即色譜條件一定，比移值（Rf）只與組分性質(zhì)有關(guān)，因此可用來(lái)鑒定化合物。（定性）但是Rf值除了決定于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)外，還與吸附劑的含水量、薄層厚度，展開(kāi)劑純度、溫度等外界因素有關(guān)，因此薄層色譜幾乎不用于定性，常用來(lái)分析樣品中的組分。四、薄層色譜（3）良好的分離，Rf值應(yīng)在0.15-0.75之五、柱色譜柱色譜：是將吸附劑（固定相）裝入一根帶有下旋塞或無(wú)下旋塞的玻璃管中，將樣品溶于溶劑，隨洗脫劑（流動(dòng)相）沿著色譜柱，進(jìn)行分離的方法。裝柱展開(kāi)及洗脫五、柱色譜柱色譜：是將吸附劑（固定相）裝入一根帶有下旋塞或無(wú)1.裝柱：是柱色譜最關(guān)鍵的操作，裝柱的好壞直接影響分離效果。（1）裝柱前，應(yīng)先將玻璃柱洗凈，干燥，垂直固定在鐵架臺(tái)上。在柱底鋪一小塊脫脂棉，再鋪約0.5cm厚的石英砂，然后進(jìn)行裝柱。有濕法和干法兩種裝柱方法。五、柱色譜（2）濕法裝柱：將固定相（如硅膠）用洗脫劑調(diào)成糊狀，在柱內(nèi)先加入約3/4柱高的洗脫劑，再將糊狀物邊震蕩邊倒入柱中，同時(shí)，打開(kāi)下旋塞，用一干凈干燥的燒杯接收洗脫劑。待糊狀物全部裝完后，用接收到的洗脫劑轉(zhuǎn)移殘留的固定相，并將柱壁上的固定相淋洗下去。裝柱過(guò)程中，應(yīng)不斷輕敲色譜柱，以使固定相填充均勻、無(wú)氣泡！整個(gè)裝柱過(guò)程中，柱內(nèi)洗脫劑的高度始終不能低于固定相最上端，否則柱內(nèi)會(huì)出現(xiàn)裂痕和氣泡！1.裝柱：是柱色譜最關(guān)鍵的操作，裝柱的好壞直接影響分離效果。五、柱色譜2.展開(kāi)及洗脫：將樣品溶解在最少量的洗脫劑中。滴加前，打開(kāi)下旋塞，使洗脫劑流出，恰好下降到固定相表面時(shí)，關(guān)閉旋塞，開(kāi)始將樣品迅速全部滴加于柱頂端后，用一事先戳孔的圓形濾紙蓋住樣品表面，以防加洗脫劑時(shí)攪動(dòng)柱頂表面。樣品加完后，打開(kāi)下旋塞，再立即加入洗脫劑進(jìn)行洗脫。色譜帶的展開(kāi)過(guò)程就是樣品的分離過(guò)程，可按顏色段收集各組分。（3）干法裝柱：在色譜柱頂端放一干凈干燥的漏斗，將干燥的吸附劑（固定相）倒入漏斗中，使其成為細(xì)流連續(xù)不斷地裝入柱中。要輕輕敲打柱身，使其填充均勻后，打開(kāi)旋塞，從頂端加入洗脫劑沖柱，以排除氣泡，并保留一定液面。五、柱色譜2.展開(kāi)及洗脫：（3）干法裝柱：五、柱色譜1.洗脫劑應(yīng)連續(xù)平穩(wěn)地加入，不能中斷。洗脫過(guò)程中的注意事項(xiàng)：2.洗脫劑流出速度應(yīng)控制在每分鐘5-10滴。下移速度太快，分離效果不好，太慢，會(huì)造成色譜擴(kuò)散或成分破壞，影響分離效果。五、柱色譜1.洗脫劑應(yīng)連續(xù)平穩(wěn)地加入，不能中斷。洗脫過(guò)