金屬-內酰胺酶抑制劑的研究進展

金屬-內酰胺酶抑制劑的研究進展

1細菌耐藥機制近年來，細菌對-內酰胺類抗生素的耐藥性逐漸成為臨床抗感染治療的主要威脅。其中-內酰胺酶的出現是導致細菌耐藥性的主要機制之一。β-內酰胺酶被分為A、B、C、D四類。其中A、C、D類依賴活性位點中的Ser殘基發(fā)揮水解活性,而B類依賴活性中心的金屬離子,故被稱為金屬β-內酰胺酶(Metallo-β-lactamase,MBL)雖然越來越多的金屬酶抑制劑被報道2材料和方法2.1肽分子與nd-1的對接不少含有巰基的化合物已被報道對MBLs有較好的抑制活性,其中不乏基于氨基酸結構設計的巰基衍生物然后用分子對接的方法模擬三肽分子與NDM-1的結合模式。對接過程在MOE2014中完成,NDM-1的晶體結構取自PDB數據庫(PDBID:3Q6X)。首先對蛋白結構加氫、質子化,將結構中的原有配體周圍口袋定義為活性位點。構建三肽分子并進行結構優(yōu)化及質子化處理,對接方法選擇ProxyTriangle,打分函數選擇LondondG。2.2ndm-1金屬酶的檢測和動力學參數的測量實驗室前期已構建pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株,NDM-1的表達、純化方法參考文獻2.33.3醇對nd-1的抑制作用的測定2.3.1酶解時間的確定在吉爾生化(上海)有限公司合成三肽分子。依據NDM-1的動力學特點,我們選擇頭孢呋辛鈉作為報告底物,在260nm波長下測定其吸光度隨酶水解時間的變化,計算反應初速度。反應的緩沖液體系為含Zn2.3.2三醇分子與抗生素聯合抗菌活性的測定重組菌株pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)復蘇后挑取單菌落培養(yǎng)至對數生長期(OD3結果與討論3.1nd-1的純化及動力學參數實驗室前期已構建好pET-28a-NDM-1-E.coliBL21(DE3)的重組菌株(NDM-1的N端添加了His-tag以便后續(xù)純化),在20℃下誘導表達20h后收集菌體,經超聲破碎后對上清中的NDM-1采用鎳柱親和層析法進行分離、純化,純化結果如圖2所示。以青霉素(氨芐西林)、頭孢菌素(頭孢呋辛、頭孢唑肟)及碳青霉烯類(美羅培南)抗生素為底物,測定NDM-1水解動力學參數見表1。結果顯示NDM-1對經典青霉素類抗生素氨芐西林的水解速率(K3.2nd-1的相互作用NDM-1屬于B1類金屬β-內酰胺酶,其活性位點處有兩個Zn離子,Zn1與H120–H122–H189(3H位點)配位,Zn2與D124–C208–H250(DCH位點)配位。氨芐西林及卡托普利與NDM-1的相互作用模式如圖3所示。氨芐西林的酰胺氧與Zn1配位,羧基氧與Zn2配位,卡托普利的巰基同時與兩個鋅離子配位,這是配體與NDM-1之間最重要的相互作用鍵。另外,氨芐西林還與NDM-1的Q123和E152形成氫鍵,卡托普利與N220形成氫鍵。通過分子對接方法研究三肽分子與NDM-1的相互作用。如圖3所示,含有半胱氨酸的三肽游離巰基均能與鋅離子發(fā)生配位,其中FCf、Fcf、FCp和Fcp的巰基同時與兩個鋅離子配位,而fCp和fcp上的巰基只與Zn2配位,其羧基Zn1配位。FCf、FCp和Fcp還與K211形成氫鍵,FCf、Fcf、Fcp和fcp與N220形成氫鍵,FCf還與Q123形成氫鍵。3.3三醇對nd-1的抑制作用3.3.1三醇對nd-1的抑制作用三肽分子對NDM-1的抑制活性IC3.3.2肽的抗菌活性三肽分子在終濃度為200μmol/L時與頭孢呋辛聯用對重組NDM-1大腸埃希菌的抑菌效果如表3所示。當頭孢呋辛濃度為0μmol/L時,6條三肽分子均不能抑制大腸埃希菌生長,說明三肽本身無抗菌活性;FCf與頭孢呋辛聯用的抑菌效果比較明顯,使頭孢呋辛對NDM-1重組菌的MIC由128μg/mL降低至32μg/mL,降低4倍;當半胱氨酸變?yōu)镈型時,Fcf與頭孢呋辛聯用的抑菌效果下降,MIC變?yōu)?4μg/mL;三肽C端D-Phe變成D-Pro或者N端L-Phe變成D-Phe時,與FCf相比,聯合抑菌效果均降低,其中fCp和fcp沒有使頭孢呋辛的MIC降低,說明無聯合抑菌效果。由此可見,聯合抑菌實驗結果與3.3.1中的IC4表面活性劑的設計及合成近年來,細菌耐藥性的發(fā)展使得金屬-β-內酰胺酶抑制劑的研發(fā)倍受關注,而多肽類抗生素的耐藥性發(fā)展相對較慢,且對臨床上多重耐藥菌的治療效果可觀,因此開發(fā)新型多肽類抗菌藥物具有重要的應用價值。本文基于NDM-1的底物氨芐西林和抑制劑卡托普利的結構,通過理性設計得到6條含有Cys的三肽。相互作用模式分析發(fā)現它們的游離巰基均能與NDM-1的鋅離子配位,與卡托普利和NDM-1的關鍵作用模式類似。通過對NDM-1的抑