Expi293 細胞 Stable Pool 構(gòu)建工藝操作規(guī)程

所屬類別：穩(wěn)定細胞株部文件編號：ACRO/QMS/GY/SCL-01文件名稱：Expi293細胞StablePool構(gòu)建工藝操作規(guī)程生效日期：2017.2.28編制：張雅慧編寫日期：2017.2.25批準人職位：部門主管批準人：批準日期：2017.2.28文件類別：GY頁數(shù)：3版本號：1.2控制級別：控制文件1目的規(guī)范Expi293細胞StablePool構(gòu)建工藝操作規(guī)程。2適用范圍本實驗室Expi293細胞的StablePool構(gòu)建實驗。3適用責任穩(wěn)定細胞株構(gòu)建組所有成員。4原理外源基因?qū)氲剿拗骷毎?，既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在，通過長時間的藥物篩選，穩(wěn)定表達抗性基因的細胞得以存活，成為優(yōu)勢細胞群，其子代細胞可在一段時間內(nèi)高效表達外源基因，從而能較長時間高水平表達目的蛋白。此時構(gòu)建的細胞株稱為StablePool。5儀器設備及實驗耗材超凈工作臺、離心機、水浴鍋、細胞計數(shù)儀、計數(shù)板、電動移液器、移液管、無菌離心管、滅菌槍頭。6試劑T17、Puromycin、Feedx、CM-19、0.2%臺盼藍7實驗操作按《超凈工作臺使用與維護標準操作規(guī)程》正確進行超凈工作臺的殺菌和使用；轉(zhuǎn)染操作需嚴格遵循《PEI瞬時轉(zhuǎn)染Exip293F標準操作規(guī)程》；轉(zhuǎn)染時細胞密度維持在1.8×106-2.2×106cells/mL，細胞活率95%以上，轉(zhuǎn)染體積50mL即可滿足需要；轉(zhuǎn)染后20h-30h，進行細胞計數(shù)及熒光計數(shù)。要求此時細胞活率處于85%以上（若有熒光標記，熒光率需在25%以上）；細胞活率及熒光率如若不符合要求，不做后續(xù)操作，從步驟7.1開始重新轉(zhuǎn)染；7.5藥物篩選過程7.5.1配置培養(yǎng)基：吸取40mL-50mLT17至無菌搖瓶中，篩選藥物為Puromycin，一般濃度為30ug/mL-60ug/mL（添加體積按照培養(yǎng)總體積計算），培養(yǎng)添加物為Feedx，添加體積為新鮮培養(yǎng)基總體積的5%，如若細胞有成團跡象，可添加1×CM-19（母液濃度一般為100×）。配置好培養(yǎng)基后，放入37℃水浴鍋中進行溫浴；7.5.2藥物篩選以1.0×106cells/mL稀釋藥篩，依照細胞密度計算所需細胞液體積；7.5.3離心操作：離心機轉(zhuǎn)速設置為750-800r/min，離心5min；7.5.4重懸操作：取10mL培養(yǎng)基重懸細胞沉淀至溫浴好的培養(yǎng)基中；7.5.5隔天進行計數(shù)及離心換液操作。具體步驟同7.5.1&7.5.2&7.5.3&7.5.4。藥物篩選第6天左右，細胞活率約為20%-60%（藥物篩選活率最低點），活率低點受多種因素影響。在藥篩期間密切觀察細胞狀態(tài)，藥物篩選第10天左右，細胞活率緩慢恢復至60%-70%，細胞密度輕微增長，此時依然按1×106cells/mL進行稀釋離心換液，通過計算，取一定體積細胞液進行離心換液。藥物篩選第18天左右，細胞狀態(tài)恢復正常。細胞倍增時間為25-30h，活率95%以上。7.6細胞庫的凍存及初步表達量檢測：細胞狀態(tài)恢復后，進行5支一級庫的凍存，同時進行SF250-50mLBatch的培養(yǎng)以進行初步表達量檢測。培養(yǎng)時間為7-10天，期間進行2-4次5%Feedx的補料，若細胞成團，可添加1×CM-19（母液濃度一般為100×）。培養(yǎng)中后期進行3-5個樣品的留樣，送檢QC。初步表達量評價后，進行10支二級庫的凍存。7.7SCL部門生產(chǎn)驗證：初步表達量結(jié)果進行初審后，若達到項目目標，視表達量及具體要求而定，進行200mL或者2L-1200mL的大體積生產(chǎn)驗證培養(yǎng)，傳遞至純化進行表達量的較準確判定及后續(xù)部門蛋白質(zhì)量檢測。培養(yǎng)時間為10天左右，期間進行2-4次5%Feedx的補料，若細胞成團，可添加一次或多次1×CM-19（母液濃度一般為100×）。培養(yǎng)中后期進行3-5個樣品的留樣送檢QC。2L-800mL&2L-1200mL的具體培養(yǎng)參數(shù)如下：8注意事項：8.1離心換液吸取細胞沉淀時必須輕柔操作；8.2項目進行過程中轉(zhuǎn)染后、藥篩過程中、藥篩結(jié)束時、細胞建庫前至少進行4次無菌驗證操作；8.3除細胞計數(shù)外所有實驗過程要求嚴格無菌操作，一旦發(fā)現(xiàn)污染必須及時處理；9相關(guān)文件《SCL細胞轉(zhuǎn)染記錄》ACRO/QMS/GY/SCL01-R01《SCL懸浮細胞實驗記錄》ACRO/QMS/GY/SCL01-R02《SCL工作液配制記錄》ACRO/QMS/GY/SCL01-R03《SCL質(zhì)量檢測報告》ACRO/QMS/GY/SCL01-R04《2L簡易系統(tǒng)檢測記錄》ACRO/QMS/GY/SCL01-R05《SCL無菌驗證操作記錄》ACRO/QMS/GY/SCL01-R06日期更新內(nèi)容更新后版本號更新人2016.5.1表頭格式修改1.1