實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌基因組DNA的提取課件

細(xì)菌基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類DNA主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA

存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。細(xì)菌基因組DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類DNA分離純化核酸總的原則：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化細(xì)胞破碎機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。DNA提取SDS（十二烷基硫酸鈉）法：SDS是有效的陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法：CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA純化（去雜質(zhì)）蛋白質(zhì)：常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。RNA：常選用RNase消化，或是用LiCl來消除大分子的RNA。酚類物質(zhì)：提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。多糖：提取液中加1％PVP。

核酸提取的一般過程細(xì)胞破碎核酸提取的一般過程核酸樣品的保存溫度：

4℃（5℃）最佳和最簡(jiǎn)單-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0核酸樣品的保存二、材料、設(shè)備及試劑

菌種：大腸桿菌DH5α設(shè)備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，渦旋振蕩器，水浴鍋（37℃、60℃）試劑：LB液體培養(yǎng)基、無水乙醇、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。二、材料、設(shè)備及試劑菌種：大腸桿菌DH5α1、細(xì)菌37℃過夜培養(yǎng)，取1ml培養(yǎng)物12000rpm室溫離心1min。2、沉淀物加入180ulTE緩沖液，充分重懸細(xì)菌；再加入20ul50mg/ml溶菌酶，混勻后于30℃溫育10min。3、12000rpm離心5min,棄上清后加入200ulBufferBTL，漩渦震蕩懸浮細(xì)胞。4、加入25ul蛋白酶K溶液，振蕩器混勻，于55℃溫育30min，每隔10min漩渦震蕩一次。5、加入220ulBufferBDL，顛倒混勻，于65℃溫育10min。6、加入220ul無水乙醇，以最大速度漩渦震蕩20s。7、轉(zhuǎn)移樣品至DNA純化柱中，純化柱下端安裝2ml收集管,12000rpm離心1min使DNA結(jié)合在純化柱上，棄去收集管。8、將DNA純化柱安裝到新的2ml收集管中，加入500ulBufferHB，12000rpm離心1min，棄去濾液。9、DNA純化柱中加入700ulDNAWashBuffer，12000rpm離心1min，棄去濾液。10、重復(fù)步驟9一次。12000rpm離心2min，干燥DNA純化柱。11、將DNA純化柱轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，加入50ul預(yù)熱（65℃）的ElutionBuffer,室溫放置3min，12000rpm離心1min。三、操作步驟1、細(xì)菌37℃過夜培養(yǎng)，取1ml培養(yǎng)物12000rpm四、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融四、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料四、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：