高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氨氯地平血藥濃度

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿中氨氯地平血藥濃度

氨基丙烯酸酯是一種抗高血壓藥物二羥吡啶，它可以阻塞血管平滑肌和心臟細(xì)胞。1材料表面1.1高效液相色譜圖見(jiàn)圖1API3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AppliedBiosystemInc.);ProminenceLC-20A超快速高效液相色譜系統(tǒng),包括LC-20AD溶劑輸送泵、SIL-20AHT自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A3在線脫氣機(jī)(日本ShimadzuTechnologiesInc.);SC-3616臺(tái)式低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);QB-600型高速振蕩混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。1.2苯磺酸氨氯地平片藥物敏感試驗(yàn)受試制劑:苯磺酸氨氯地平片(河北東風(fēng)藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每片5mg,批號(hào):12033001,含量:100.5%);參比制劑:苯磺酸氨氯地平片(商品名:絡(luò)活喜,輝瑞制藥有限公司,規(guī)格:每片5mg,批號(hào):1105116,含量:99.5%);苯磺酸氨氯地平對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院,純度:99.5%);內(nèi)標(biāo):鹽酸苯海拉明(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院,純度:99.9%);甲醇為色譜純,水為超純水(去離子水經(jīng)KLZ艾柯純水機(jī)純化),其他試劑均為分析純?？瞻兹搜獫{由航天中心醫(yī)院提供或來(lái)自于健康受試者。2方法和結(jié)果2.1離子噴電預(yù)柱:PhenomenexC離子源:電噴霧電離(ESI)離子化源;離子噴射電壓:5200V;溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2.2溶液的制備2.2.1含氨氯地平貯備液的配制準(zhǔn)確稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品適量,以甲醇-水(3∶1,V/V,以下簡(jiǎn)稱為“甲醇水溶液”)溶解配制成含氨氯地平1.00mg/ml的貯備液。2.2.2對(duì)照品血漿分別取貯備液適量,用空白血漿稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為0.10、0.30、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0ng/ml的對(duì)照品血漿。2.2.3質(zhì)量控制qc示例分別取儲(chǔ)備液適量,用空白血漿稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為0.30、2.0、8.0ng/ml的QC樣本。2.2.4qc溶液分別取儲(chǔ)備液適量,用甲醇水溶液稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為1.5、10.0、40.0ng/ml的QC溶液。2.2.5含苯海拉明貯備液的配制準(zhǔn)確稱取鹽酸苯海拉明對(duì)照品適量,用甲醇水溶液溶解配制成含苯海拉明0.10mg/ml的貯備液。取貯備液適量,甲醇水溶液稀釋成2.5ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。2.3lc-ms/ms分析取血漿500μl分別加入內(nèi)標(biāo)溶液50μl、甲醇水溶液100μl、0.2mol/L氫氧化鈉溶液(NaOH)100μl、正己烷-二氯甲烷-異丙醇(20∶10∶1,V/V/V)3ml,渦流1min,振蕩12min,3500r/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液,在40℃恒溫浴下氮?dú)獯蹈?殘?jiān)眉状妓芤?50μl復(fù)溶,渦流30s,復(fù)溶后的溶液全部轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行LC-MS/MS分析。2.4方法驗(yàn)證2.4.1海拉明的二級(jí)全掃描質(zhì)譜分別將氨氯地平溶液(500ng/ml)和苯海拉明溶液(500ng/ml),用蠕動(dòng)泵以10μl/min的恒定速度泵入MS/MS系統(tǒng),進(jìn)行碎片離子分析,相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。2.4.2內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)氨氯地平和苯海拉明測(cè)定的影響分別取6個(gè)不同來(lái)源的空白血漿,以等體積的甲醇水溶液代替內(nèi)標(biāo)溶液,按“2.3”項(xiàng)下方法處理測(cè)定,氨氯地平和苯海拉明的保留時(shí)間分別為2.79min和2.43min,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氨氯地平和苯海拉明的測(cè)定。其典型色譜圖見(jiàn)圖2。2.4.3基質(zhì)效應(yīng)因子按“2.3”項(xiàng)下方法處理6個(gè)不同來(lái)源空白血漿,得到空白血漿基質(zhì)后,再加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液,處理后進(jìn)樣得到的峰面積除以相應(yīng)濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣得到的峰面積,計(jì)算血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)氨氯地平和苯海拉明的基質(zhì)效應(yīng)因子。結(jié)果血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣本中氨氯地平的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為(71.2±7.5)%、(73.3±6.1)%和(85.1±2.9)%,平均基質(zhì)效應(yīng)因子為(76.5±8.4)%;血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)苯海拉明的基質(zhì)效應(yīng)因子為(64.4±2.6)%。2.4.4血漿中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的測(cè)定分別取對(duì)照品血漿500μl,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,以血漿中待測(cè)物濃度(x)為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo),用加權(quán)(W-1/X2.4.5方法的回收率及待測(cè)物濃度分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,每個(gè)濃度6個(gè)樣本,連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批,根據(jù)相應(yīng)分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣本中待測(cè)物的濃度。結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均>15%,相對(duì)偏差(RE)均在±15%以內(nèi)。準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果見(jiàn)表1。2.4.6提取回收率分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,每個(gè)濃度6個(gè)樣本,以其進(jìn)樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的QC溶液及內(nèi)標(biāo)溶液后進(jìn)樣得到的峰面積,計(jì)算血漿中氨氯地平和苯海拉明的提取回收率。結(jié)果低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣本中氨氯地平的提取回收率分別為(81.1±4.9)%、(86.0±5.2)%、(87.0±5.3)%,平均提取回收率為(84.7±5.5)%;血漿樣本中苯海拉明的提取回收率為(88.9±3.5)%。2.4.7不同冷凍放置血漿樣品穩(wěn)定性分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項(xiàng)下方法操作,每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)樣本,考察血漿樣本室溫避光放置8h、經(jīng)3次凍融、-80℃長(zhǎng)期冰凍放置35d后及血漿樣本經(jīng)處理后于自動(dòng)進(jìn)樣器中室溫放置9h氨氯地平的穩(wěn)定性。結(jié)果所有測(cè)定濃度與理論濃度的RE均在±15%以內(nèi),表明在血漿樣本室溫放置、反復(fù)凍融、長(zhǎng)期冰凍放置過(guò)程中,以及處理后分析測(cè)定過(guò)程中,氨氯地平均穩(wěn)定,各種貯存條件不影響對(duì)樣本的準(zhǔn)確測(cè)定。2.5生物等效試驗(yàn)2.5.1體質(zhì)量、織物體質(zhì)量及指數(shù)24名健康男性志愿者,平均年齡(23±2)歲,體質(zhì)量(61.8±4.6)kg,身高(1.70±0.05)m,體質(zhì)量指數(shù)(21.4±1.2)kg/m2.5.2被試制劑及參比制劑采用單劑量口服、隨機(jī)、開(kāi)放、兩周期、交叉設(shè)計(jì)方法進(jìn)行苯磺酸氨氯地平片的人體生物等效性試驗(yàn)。在2個(gè)試驗(yàn)周期,24名受試者分別空腹口服受試制劑或參比制劑,劑量均為5mg。2個(gè)周期間清洗期為14d。分別于給藥前(0h)和給藥后1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120h由上肢靜脈采血5ml,置肝素化離心試管中,搖勻,2500r/min離心(4℃)5min分離血漿,并于-80℃冷凍保存,待測(cè)。2.6生物等效性評(píng)價(jià)應(yīng)用本方法測(cè)定受試者口服受試制劑和參比制劑后不同時(shí)間血