高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中氨氯地平血藥濃度

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中氨氯地平血藥濃度

氨基丙烯酸酯是一種抗高血壓藥物二羥吡啶，它可以阻塞血管平滑肌和心臟細胞。1材料表面1.1高效液相色譜圖見圖1API3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國AppliedBiosystemInc.);ProminenceLC-20A超快速高效液相色譜系統(tǒng),包括LC-20AD溶劑輸送泵、SIL-20AHT自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A3在線脫氣機(日本ShimadzuTechnologiesInc.);SC-3616臺式低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);QB-600型高速振蕩混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);MTN-2800D氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。1.2苯磺酸氨氯地平片藥物敏感試驗受試制劑:苯磺酸氨氯地平片(河北東風藥業(yè)有限公司,規(guī)格:每片5mg,批號:12033001,含量:100.5%);參比制劑:苯磺酸氨氯地平片(商品名:絡活喜,輝瑞制藥有限公司,規(guī)格:每片5mg,批號:1105116,含量:99.5%);苯磺酸氨氯地平對照品(中國藥品生物制品檢定研究院,純度:99.5%);內(nèi)標:鹽酸苯海拉明(中國藥品生物制品檢定研究院,純度:99.9%);甲醇為色譜純,水為超純水(去離子水經(jīng)KLZ艾柯純水機純化),其他試劑均為分析純?？瞻兹搜獫{由航天中心醫(yī)院提供或來自于健康受試者。2方法和結(jié)果2.1離子噴電預柱:PhenomenexC離子源:電噴霧電離(ESI)離子化源;離子噴射電壓:5200V;溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1,N2.2溶液的制備2.2.1含氨氯地平貯備液的配制準確稱取苯磺酸氨氯地平對照品適量,以甲醇-水(3∶1,V/V,以下簡稱為“甲醇水溶液”)溶解配制成含氨氯地平1.00mg/ml的貯備液。2.2.2對照品血漿分別取貯備液適量,用空白血漿稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為0.10、0.30、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0ng/ml的對照品血漿。2.2.3質(zhì)量控制qc示例分別取儲備液適量,用空白血漿稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為0.30、2.0、8.0ng/ml的QC樣本。2.2.4qc溶液分別取儲備液適量,用甲醇水溶液稀釋,配制成氨氯地平質(zhì)量濃度為1.5、10.0、40.0ng/ml的QC溶液。2.2.5含苯海拉明貯備液的配制準確稱取鹽酸苯海拉明對照品適量,用甲醇水溶液溶解配制成含苯海拉明0.10mg/ml的貯備液。取貯備液適量,甲醇水溶液稀釋成2.5ng/ml的內(nèi)標溶液。2.3lc-ms/ms分析取血漿500μl分別加入內(nèi)標溶液50μl、甲醇水溶液100μl、0.2mol/L氫氧化鈉溶液(NaOH)100μl、正己烷-二氯甲烷-異丙醇(20∶10∶1,V/V/V)3ml,渦流1min,振蕩12min,3500r/min離心5min,轉(zhuǎn)移上清液,在40℃恒溫浴下氮氣吹干,殘渣用甲醇水溶液150μl復溶,渦流30s,復溶后的溶液全部轉(zhuǎn)移至進樣瓶中進行LC-MS/MS分析。2.4方法驗證2.4.1海拉明的二級全掃描質(zhì)譜分別將氨氯地平溶液(500ng/ml)和苯海拉明溶液(500ng/ml),用蠕動泵以10μl/min的恒定速度泵入MS/MS系統(tǒng),進行碎片離子分析,相應的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。2.4.2內(nèi)源性物質(zhì)對氨氯地平和苯海拉明測定的影響分別取6個不同來源的空白血漿,以等體積的甲醇水溶液代替內(nèi)標溶液,按“2.3”項下方法處理測定,氨氯地平和苯海拉明的保留時間分別為2.79min和2.43min,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾氨氯地平和苯海拉明的測定。其典型色譜圖見圖2。2.4.3基質(zhì)效應因子按“2.3”項下方法處理6個不同來源空白血漿,得到空白血漿基質(zhì)后,再加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液,處理后進樣得到的峰面積除以相應濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液直接進樣得到的峰面積,計算血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對氨氯地平和苯海拉明的基質(zhì)效應因子。結(jié)果血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對低、中、高3個質(zhì)量濃度血漿樣本中氨氯地平的基質(zhì)效應因子分別為(71.2±7.5)%、(73.3±6.1)%和(85.1±2.9)%,平均基質(zhì)效應因子為(76.5±8.4)%;血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對苯海拉明的基質(zhì)效應因子為(64.4±2.6)%。2.4.4血漿中待測物與內(nèi)標物峰面積比值的測定分別取對照品血漿500μl,按“2.3”項下方法操作,以血漿中待測物濃度(x)為橫坐標,待測物與內(nèi)標物的峰面積比值(y)為縱坐標,用加權(quán)(W-1/X2.4.5方法的回收率及待測物濃度分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項下方法操作,每個濃度6個樣本,連續(xù)測定3個分析批,根據(jù)相應分析批的標準曲線計算QC樣本中待測物的濃度。結(jié)果日內(nèi)、日間RSD均>15%,相對偏差(RE)均在±15%以內(nèi)。準確度與精密度結(jié)果見表1。2.4.6提取回收率分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項下方法操作,每個濃度6個樣本,以其進樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)處理后再加入低、中、高3個質(zhì)量濃度的QC溶液及內(nèi)標溶液后進樣得到的峰面積,計算血漿中氨氯地平和苯海拉明的提取回收率。結(jié)果低、中、高3個質(zhì)量濃度血漿樣本中氨氯地平的提取回收率分別為(81.1±4.9)%、(86.0±5.2)%、(87.0±5.3)%,平均提取回收率為(84.7±5.5)%;血漿樣本中苯海拉明的提取回收率為(88.9±3.5)%。2.4.7不同冷凍放置血漿樣品穩(wěn)定性分別取氨氯地平的QC樣本,按“2.3”項下方法操作,每個質(zhì)量濃度3個樣本,考察血漿樣本室溫避光放置8h、經(jīng)3次凍融、-80℃長期冰凍放置35d后及血漿樣本經(jīng)處理后于自動進樣器中室溫放置9h氨氯地平的穩(wěn)定性。結(jié)果所有測定濃度與理論濃度的RE均在±15%以內(nèi),表明在血漿樣本室溫放置、反復凍融、長期冰凍放置過程中,以及處理后分析測定過程中,氨氯地平均穩(wěn)定,各種貯存條件不影響對樣本的準確測定。2.5生物等效試驗2.5.1體質(zhì)量、織物體質(zhì)量及指數(shù)24名健康男性志愿者,平均年齡(23±2)歲,體質(zhì)量(61.8±4.6)kg,身高(1.70±0.05)m,體質(zhì)量指數(shù)(21.4±1.2)kg/m2.5.2被試制劑及參比制劑采用單劑量口服、隨機、開放、兩周期、交叉設計方法進行苯磺酸氨氯地平片的人體生物等效性試驗。在2個試驗周期,24名受試者分別空腹口服受試制劑或參比制劑,劑量均為5mg。2個周期間清洗期為14d。分別于給藥前(0h)和給藥后1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120h由上肢靜脈采血5ml,置肝素化離心試管中,搖勻,2500r/min離心(4℃)5min分離血漿,并于-80℃冷凍保存,待測。2.6生物等效性評價應用本方法測定受試者口服受試制劑和參比制劑后不同時間血