一種去除RNA樣本中rRNA的方法與流程

一種去除RNA樣本中rRNA的方法與流程背景介紹在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的時(shí)候，我們需要分離出mRNA，并去除RNA樣本中的rRNA，因?yàn)閞RNA占據(jù)了大部分的RNA樣本量，如果不去除rRNA，會(huì)對(duì)后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析產(chǎn)生干擾。因此，去除RNA樣本中的rRNA是轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。目前主要的去除rRNA方法Poly(A)選擇法Poly(A)選擇法是一種廣泛使用的去除rRNA的方法?；驹硎抢胷RNA不帶有Poly(A)尾巴的特點(diǎn)，通過Oligo(dT)親和層析材料選擇出Poly(A)尾部帶有Poly(A)尾巴的mRNA，從而在RNA樣品中去除了rRNA。缺點(diǎn)是可能有rRNA也帶有Poly(A)尾巴，所以仍然會(huì)有一定程度的rRNA污染。rRNA特異性雜交寡核苷酸去除法把rRNA與某種特異性雜交寡核苷酸探針結(jié)合，從RNA混合物中抽取所有rRNA，一種非常有效的去除rRNA方法。其優(yōu)點(diǎn)是能夠特異性去除rRNA，缺點(diǎn)是可能會(huì)有一些非特異性的雜交發(fā)生。堿基對(duì)互補(bǔ)雜交法這種方法是利用小片段RNA的堿基序列與rRNA互補(bǔ)配對(duì)來形成RNA-RNA雙鏈，形成雙鏈結(jié)構(gòu)后，采用RNA酶H切割RNA區(qū)域，從而去除rRNA。這種方法能有效地去除rRNA，但也有一定程度的非特異性去除其他RNA問題。序列捕獲法序列捕獲法是一種高通量的去除rRNA方法?；谛蛄谢パa(bǔ)的思想，序列捕獲是一種針對(duì)rRNA的高效去除方法，通過合成一些特定的rRNA探針，在靶RNA中尋找相應(yīng)的序列，并將其裁剪掉。該方法可以特異性地選擇性地去除rRNA。本文介紹一種修改版的rRNA去除方法和流程實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備核酸分離柱（如RNAClean&ConcentratorTM-5）rRNA去除試劑盒（如Ribo-ZeroTMrRNARemovalKit）10%聚丙烯酰胺凝膠（theBio-RadCriterionTXCPrecastGel）電泳開發(fā)劑（theBio-RadElectrophoresis1XMOPSRunningBuffer）分子生物學(xué)級(jí)水（如UltraPureTMDNase/RNase-FreeDistilledWater）樣品制備從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織中提取總RNA。將總RNA通過核酸分離柱純化，去除蛋白質(zhì)、DNA和其他殘余物質(zhì)。rRNA去除過程在脫除rRNA反應(yīng)中添加rRNA去除試劑盒中的試劑，然后與總RNA混合，室溫下反應(yīng)15分鐘。使用磁珠來去除富集的rRNA。將寡核苷酸探針加入RNA樣品中，進(jìn)行雜交反應(yīng)。用Dynabeads進(jìn)行寡核苷酸-寡核苷酸雜交后的產(chǎn)物分離。在3000r/min的旋轉(zhuǎn)速度下離心，在聚丙烯酰胺凝膠上運(yùn)行電泳。實(shí)驗(yàn)后處理在上一步中，RNA被經(jīng)過核酸分離柱處理過的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用級(jí)水溶解后加入聚丙烯酰胺凝膠中。在10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，以去除剩余的rRNA。研磨凝膠進(jìn)行乙酸鉈染色并用分峰器分離RNA。結(jié)論rRNA去除是轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中的重要步驟，目前存在許多可用的方法。本文介紹了一種修改版的rRNA去除方法，該方法比傳統(tǒng)的P