抗原和抗體的制備

抗原和抗體的制備第1頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)抗原的準(zhǔn)備天然抗原的制備人工抗原的制備合成抗原第2頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原制備的主要技術(shù)途徑天然抗原——分離、純化半抗原——人工合成、載體聯(lián)接抗原肽——合成、基因工程制備第3頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月天然抗原的制備顆?？乖闹苽淇扇苄钥乖鞍卓乖嗵强乖?/p>

第4頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月顆?？乖闹苽?、血紅細(xì)胞抗原的制備：動物的新鮮血液+抗凝劑

離心去上清

NS懸浮

離心洗滌三次（2000轉(zhuǎn)/分）

第5頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

綿羊紅細(xì)胞的制備流程圖4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%搖動15-20min第6頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月顆?？乖闹苽?、細(xì)菌抗原的制備細(xì)菌培養(yǎng)（37℃，24小時(shí)）殺菌（100℃，2小時(shí)）

NS稀釋

菌體抗原第7頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

細(xì)菌細(xì)胞抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)37℃24h100℃水浴2～2.5h殺菌無活菌試驗(yàn)NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原第8頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月種類：蛋白質(zhì)多糖和細(xì)菌毒素。細(xì)胞內(nèi)存在的部位：胞外抗原和胞內(nèi)抗原。胞外抗原:收集培養(yǎng)液或分泌物。胞內(nèi)抗原:提取、分離和純化?？扇苄钥乖姆蛛x純化第9頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月胞內(nèi)抗原的提取、分離和純化細(xì)胞的破碎分離純化第10頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.酶處理法2.凍融法3.超聲破碎法4.表面活性劑處理細(xì)胞的破碎第11頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1、酶處理法常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等

特點(diǎn)：①適用于多種微生物；②作用條件溫和；③內(nèi)含物成分不易受到破壞；④細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。第12頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月2、凍融法原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。方法：將待破碎的細(xì)胞置冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后緩慢融化，如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。特點(diǎn)：適用于組織細(xì)胞，對微生物細(xì)胞作用較差。第13頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月3、超聲破碎法原理：①利用超聲波的機(jī)械振動而使細(xì)胞破碎。②超聲波使用的頻率從1kHz～20kHz，③間歇進(jìn)行，避免長期超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。特點(diǎn)：①操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；②多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。第14頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月4、表面活性劑處理法原理：在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。常用的有：十二烷基硫酸鈉(SDS,陰離子型)、二乙胺十六烷基溴（陽離子型）、聚山梨酯（非離子型）、新潔爾滅等。應(yīng)用：破碎細(xì)菌，且作用比較溫和。第15頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原的純化1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠層析法4.離子交換層析法5.親合層析法第16頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1、超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、載脂蛋白A、B等。第17頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同），常用33～50％飽和度的硫酸胺。特點(diǎn)：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。第18頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月3、凝膠層析法原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時(shí)，由于分子大小的不同先后被洗脫出來，從而實(shí)現(xiàn)對不同分子大小的物質(zhì)進(jìn)行分離。常用的如：如葡聚糖凝膠填料（sephadex柱）第19頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月凝膠層析（分子篩）第20頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月4、離子交換層析法原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個(gè)部分而被洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。第21頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月離子交換層析+++———————++++++++——+++——++第22頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月5、親和層析法原理：依據(jù)抗原抗體的生物學(xué)活性進(jìn)行分離和提純的技術(shù)。將純化的抗IgG附著于惰性的固相基質(zhì)上，制成免疫吸附層析柱。當(dāng)樣品流過此柱時(shí)，待分離的IgG可選擇性地與免疫吸附劑上的特異性配體(抗IgG)結(jié)合；當(dāng)改變洗脫條件可重新解離，將待分離的Ig洗脫下來，達(dá)到純化的目的。優(yōu)點(diǎn)：提取純度高、抗原抗體不失活性。第23頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月正常細(xì)胞＋標(biāo)記細(xì)胞洗滴標(biāo)記細(xì)胞被酶裂解加入特異性抗體其它蛋白洗滌流失SDS分離蛋白

親和層析法示意圖第24頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月親和層析第25頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月抗原的鑒定1.含量鑒定：凱氏定氮法

2.理化性質(zhì)鑒定①凝膠層析技術(shù)測定②聚丙烯酰胺凝膠電泳③凝膠管狀電泳④超速離心3.純度鑒定

常用醋酸纖維膜電泳

4.免疫活性鑒定

常用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)第26頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月半抗原免疫原的制備

1.半抗原：低分子量的化學(xué)物質(zhì)。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些藥物(包括抗生素）及其他化學(xué)物品等。2.載體：蛋白質(zhì)類多肽聚合物大分子聚合物3.半抗原-載體連接方法第27頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月半抗原

+載體抗體BT完全抗原BBBT第28頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月載體類型1.蛋白質(zhì)：

人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。2.多肽聚合物：

人工合成的，常見的有多聚賴氨酸，其分子量大（可達(dá)十幾萬到幾十萬)，這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激免疫動物產(chǎn)生高效價(jià)、高親和力的抗體。3.大聚合物：

羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑亦可誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。第29頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

半抗原-載體連接方法1碳化二亞胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋載體蛋白質(zhì)攪拌1～2h室溫24h透析除去未反應(yīng)的半抗原人工免疫原半抗原載體連接方法1混合第30頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月混合戊二醛法:半抗原-NH2載體蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-載體蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的帶有兩個(gè)活性基團(tuán)的雙功能聯(lián)接劑半抗原載體連接方法2第31頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

半抗原-載體連接方法3氯甲酸異丁脂法：半抗原-COOH載體蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-載體蛋白半抗原載體連接方法3簡便，用于類固醇抗原制備HO-CH2CH(CH3)2＋第32頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

半抗原-載體連接方法4琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制備半抗原-CH2OHCH2-COCH2-CO帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH吡啶再經(jīng)氯甲酸異丁脂法或碳化二亞胺法制備載體半抗原半抗原載體連接方法4第33頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

佐劑

概念：

能非特異地通過物理或化學(xué)方法與抗原結(jié)合從而增強(qiáng)其特異性免疫原性的物質(zhì)。條件：①增加抗原的表面積；②改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型；③佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時(shí)間；④可直接或間接激活免疫活性細(xì)胞；⑤無毒性或無副作用。第34頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）常用佐劑的種類和制備1.氫氧化鋁佐劑：5%硫酸鋁5%氫氧化鈉氫氧化鋁沉淀制成懸液即為佐劑強(qiáng)烈攪拌NS洗二次NS等體積抗原免疫接種常用佐劑的種類及制備第35頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.明礬佐劑10%硫酸鉀鋁氫氧化鈉校正pH值至6.5沉淀乳狀懸液*明礬佐劑抗原常用于肌肉注射，皮下注射易引起肉芽種和膿腫。NS攪拌NS洗二次離心抗原備用防腐劑第36頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月作用大于不完全佐劑局部形成肉芽種和潰瘍不能用于人體弗氏完全佐劑

3.弗氏佐劑(Freundadjuvant)液體石蠟完全乳化備用＋高壓滅菌加熱抗原弗氏不完全佐劑卡介苗羊毛脂鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中混合第37頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

①增強(qiáng)抗原對機(jī)體的免疫原性；②增強(qiáng)抗體的產(chǎn)生能力；③為制備出高效價(jià)的免疫血清；⑤在某種情況下，改變Ag免疫應(yīng)答類型；⑥延長抗原在免疫動物的時(shí)間；⑧增強(qiáng)局部對變應(yīng)原的超敏反情況。佐劑的作用第38頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月人工抗原及基因工程抗原用化學(xué)合成法或基因重組法制備含有已知化學(xué)結(jié)構(gòu)決定簇的抗原，稱之為人工抗原。它可包括人工結(jié)合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。第39頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月人工合成抗原用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽。應(yīng)用這種人工合成多肽可作為抗原。只由一種氨基酸形成的聚合體稱為同聚多肽，如由左旋賴氨酸形成的同聚多肽。由二種或二種以上氨基酸形成的聚合多肽稱為共聚多肽，如由酪氨酸、谷氨酸與多聚丙氨酸和賴氨酸組成的聚合成多肽。第40頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程抗原將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當(dāng)載體DNA分子相結(jié)合，然后引入受體細(xì)胞中使之表達(dá)，即能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后即基因工程疫苗?；蚬こ桃倚透窝撞《疽呙绾驮谂６幻绫磉_(dá)系統(tǒng)中研制乙肝病毒的重組感染載體的多價(jià)疫苗。第41頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月小結(jié)抗原的種類顆粒性抗原的制備可溶性抗原提取分離純化方法抗原的鑒定半抗原免疫原的制備佐劑的作用第42頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)抗體的制備多克隆抗體的制備單克隆抗體技術(shù)基因工程抗體第43頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月多克隆抗體的制備1.免疫動物選擇2.免疫方法3.動物采血法4.免疫血清的分離及保存

第44頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫動物的選擇能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。免疫動物的選擇原則：1.抗原與免疫動物種屬差異越遠(yuǎn)越好；2.動物必須適齡、健壯、無感染的正常動物、體重合乎要求；3.不同動物種類對同一免疫原有不同的免疫應(yīng)答；4.按需要量選擇大小不同的動物。第45頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫方法1.免疫原的注射劑量2.免疫途徑：免疫反應(yīng)產(chǎn)生速度依次為靜脈＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)＞淋巴結(jié)＞足掌3.免疫方案①全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注射

②微量免疫法：卡介苗弗氏佐劑抗原③混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈7天1月第46頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月1.頸動脈放血法2.心臟采血法3.靜脈采血法動物采血法第47頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月免疫血清的分離和保存免疫血清的分離1、室溫自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝塊收縮，分離血清。2、抗血清分出后要經(jīng)56℃30min滅活。免疫血清的保存1.4℃保存：可保存3～6個(gè)月2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年3.冰凍干燥保存：可保存3～5年第48頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性抗體的純化1.親合層析法：將交叉抗原交聯(lián)到Sepharose上，裝柱后，將預(yù)吸收的抗體通過親合層析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液則是特異性抗體。2.吸附法：利用不含特異性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原則與抗體結(jié)合，上清液則為無雜抗體的單價(jià)特異性抗體。第49頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性IgG抗體的純化1.鹽吸沉淀法：經(jīng)硫酸銨鹽析提取γ球蛋白3次，基本為IgG類抗體，但不純。2.A蛋白親和層析：SPA與IgG的Fc段有很強(qiáng)的特異性的親和力，細(xì)菌表面不同位點(diǎn)獨(dú)立地與抗體結(jié)合，一個(gè)A蛋白至少可以結(jié)合二個(gè)IgG分子。適合純化細(xì)胞培養(yǎng)上清中的McAb。3.其它：凝膠過濾、離子交換層析等第50頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性抗體的鑒定1.抗體效價(jià)的鑒定：即為抗體活性滴定2.抗體特異性鑒定

①細(xì)菌類抗原的抗體用凝集試驗(yàn)②可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)3.抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好第51頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月親合力親合力是指抗體與結(jié)合抗原的活度或牢固度?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間。第52頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體：由B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的只識別抗原分子上一種抗原決定簇的抗體分子。第53頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月

雜交瘤技術(shù)的原理及流程第54頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月HAT培養(yǎng)基是含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸的完全培養(yǎng)基。在氨基蝶呤(二氫葉酸類似物)存在下，這種酶缺陷的細(xì)胞不能通過核苷酸合成旁路合成次黃嘌呤和胸苷。制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來。B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長期生長，一般于二周內(nèi)均死亡。PEG：聚乙二醇

第55頁，課件共61頁，創(chuàng)作于2023年2月單克隆抗體的特性