小鼠肝臟RNA的提取純化與鑒定

分子生物學(xué)試驗(yàn)報(bào)告一、試驗(yàn)時(shí)間20231121日10:00—17:30二、試驗(yàn)內(nèi)容RNA的提取純化與鑒定三、試驗(yàn)?zāi)康腞NA提取的根本原理、應(yīng)用及操作的留意RNA提取方法及其檢測(cè)方法。四、試驗(yàn)原理：RNAcDNAcDNA文庫(kù)Northern印跡RNA分光光度法進(jìn)展定量。RNARNA酶分布廣、活RNARNA降解。抑制RNARNA酶對(duì)RNA的降解。焦磷酸二乙酯〔DEPC〕RNA酶RNA酶的活性。DEPC是消退RNA0.1%DEPC處理試驗(yàn)器皿與試劑配制用水，根本可以消退外源RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用時(shí)肯定要留意。DEPC處理的器皿與水必需經(jīng)高壓滅菌處理，使DEPC分解前方能使用。值得留意的是，DEPC具有很強(qiáng)的反響性，能夠與RNA在內(nèi)的多種生物分子以及多種化學(xué)試劑作用，因此不能直RNA酶活性。RNARNA酶活性的主要方法。作為一種蛋白變性劑，異硫氰酸胍可導(dǎo)致包括RNARNA純化過(guò)程中因盡可能去除異RNARNA的降解。RNARNA產(chǎn)生破壞。在這種狀況下，最適宜的方法是RNARNA酶抑制劑本身是蛋白質(zhì)，可RNARNA的逆轉(zhuǎn)錄以及體外翻譯等過(guò)程均無(wú)干擾。RNADNA與蛋白質(zhì)，最常用的方法是酸性DNARNA，同時(shí)酚又是蛋RNA的分別。最終利用異丙醇沉淀，即可獲得純化的總RNA。RNARNA其A

應(yīng)處于6至8

RNA濃度呈正相關(guān)。RNARNA為單鏈分子，二級(jí)構(gòu)造簡(jiǎn)單ARNA包含了三種主要組分，其中rRNA含量最高，因此在電泳18S28SrRNA的條帶。如兩條條帶清楚，且亮度之比1:2，則說(shuō)明RNA沒(méi)有發(fā)生降解。一般狀況下泳道前緣還可觀看5S5.8SrRNAtRNA組較少且長(zhǎng)度不均一，一般觀看不到相應(yīng)的條帶。RNA18S與28SrRNARNA進(jìn)展定量與RNA產(chǎn)物的濃度與含量。五、主要試驗(yàn)試劑與儀器 ：QIAGEN。20.1%DEPC12h，12115min，枯燥即可使用。3RNA0.1%DEPCSAGON，37℃12h，12115min。4、TrizolTakara公司。5、氯仿6、異丙醇7、75%乙醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑。S〔H，乙酸鈉，A〔。AM〔，溴酚藍(lán)。六、試驗(yàn)方法與步驟：〔一〕RNA的抽提50~100mgTrizol1ml10分鐘。12023rpm10min，取上清。參加氯仿0.2ml,猛烈震蕩15s,4℃放置10min,12023rpm離心15min,三相，即上層的水相，下層的有機(jī)相以及中間的變性蛋白，留神吸取上層水相，絕不能有中層蛋白混入。參加異丙醇℃放置m離心50%3上清液的體積相當(dāng)。1ml75%8000rpm5min〔假設(shè)管壁仍有殘留液體，連續(xù)離心，吸取殘留液體〕乙醇洗滌的目的是去除沉淀中殘留的鹽分。沉淀空氣枯燥溶解于ll℃保存?zhèn)溆??！捕匙贤夥止夤舛确y(cè)定純度和含量承受nanodrop儀器測(cè)定RNAblank，1μl樣品測(cè)定，讀取數(shù)值。(三)RNA的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)1×甲醛變性凝膠電泳緩沖液,10mlEB,混合均勻并灌制膠板。由于甲醛具有揮發(fā)性，不能直接加熱，必需對(duì)凝膠單獨(dú)加熱溶化后參加。2μlRNA8μl,655分鐘，快速冰浴冷卻，點(diǎn)樣。加熱后快速冷卻的目的是防止RNA復(fù)性。150V30分鐘，紫外光下觀看電泳結(jié)果。七、試驗(yàn)結(jié)果：紫外分光光度法檢測(cè)濃度: 3883.5ng/μlA260：97.088A280：47.770260/280：2.03260/230：1.11電泳檢測(cè)我的結(jié)果28s18s5s八、爭(zhēng)論：nanodrop260/280=2.032.0，說(shuō)明已有部RNA降解了。緣由可能有家氯仿萃取離心取上清時(shí)吸到了中層的RNA分解酶會(huì)分解RNA導(dǎo)致測(cè)量值偏高。260/230=1.11，說(shuō)明有雜質(zhì)，純度不高，可能有蛋白質(zhì)和胍鹽殘留，胍鹽殘留可能是乙醇洗滌不完全。RNADNA等污染，也有由于電極緩沖液配置問(wèn)題，跑膠時(shí)，溫度過(guò)高，導(dǎo)致效果較差的緣由。九、試驗(yàn)思考題 ：1RNA沉淀：DNA分子仍舊很大，溶液粘稠。變性的DNARNA，使之不能有效地釋放到溶液中。2、RNA抽提率低的緣由：樣品均化或裂解不完全:勻漿不完全時(shí)，RNA分子易被蛋白質(zhì)和DNA復(fù)合物包裹，不能被有效釋放。RNA不完全溶解:RNA喪失。3、A260/A2801.652.0表示何意：1.65：TERNApH280nm處的光吸取值。TRIZOL量太少。分別的水樣層中污染有苯酚層。RNA沒(méi)有完全溶解。2.0：RNA因