微生物檢驗(yàn) 第三篇 病毒

臨床病毒學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)體積微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，非細(xì)胞型微生物只含一種核酸在活細(xì)胞內(nèi)寄生以復(fù)制方式進(jìn)行增殖對(duì)抗生素不敏感，干擾素可抑制其增殖；葡萄球菌(1000nm）牛痘病毒300×250nmABCDEFG立克次體450nm衣原體390nmA、大腸桿菌噬菌體(65×95nm)B、腺病毒(70nm)D、乙腦病毒(40nm)E、蛋白分子(10nm

)F、流感病毒(100nm)G、煙草花葉病毒C、脊髓灰質(zhì)炎病毒(30nm)

形態(tài)球形桿形子彈狀磚塊狀蝌蚪狀病毒體結(jié)構(gòu)模式圖殼粒衣殼核心（核樣物）核衣殼包膜包膜病毒包膜子粒吸附穿入脫殼生物合成釋放組裝成熟

病毒沒(méi)有正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，缺乏一些與代謝有關(guān)的酶，單獨(dú)不能復(fù)制，必須在活細(xì)胞內(nèi)增殖

第二節(jié)病毒的增殖裸露病毒：胞飲作用不同病毒，穿入方式不同包膜病毒：包膜與細(xì)胞膜融合噬菌體：注入式病毒的配體位點(diǎn)與細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合三、脫殼不同病毒脫殼方式不同多數(shù)病毒在宿主細(xì)胞溶酶體酶作用下脫殼四、生物合成宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在病毒基因控制下的病毒核酸和蛋白質(zhì)的合成過(guò)程先合成一些復(fù)制酶、抑制蛋白，抑制宿主細(xì)胞的正常代謝，使細(xì)胞代謝向著有利于病毒合成的方向進(jìn)行再依據(jù)病毒基因組的指令，進(jìn)行病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯六、釋放出芽釋放溶細(xì)胞釋放組裝：DNA病毒：一般在核內(nèi)組裝RNA病毒：多數(shù)在胞漿內(nèi)組裝病毒的致病作用水平傳播（Horizontaltransmission）病毒主要通過(guò)皮膚、粘膜（呼吸道、消化道、泌尿生殖道）傳播，在特定條件下直接進(jìn)入血液（輸血、機(jī)械損傷、昆蟲(chóng)叮咬等）而感染機(jī)體。所引起的感染，叫水平感染(Horizontalinfection)

垂直傳播（Verticaltransmission

）

經(jīng)胎盤(pán)、產(chǎn)道，病毒直接由親代(母親)傳播給子代(胎兒/新生兒)的傳播方式。導(dǎo)致的感染，稱(chēng)為垂直感染(Verticalinfection）

病毒感染的類(lèi)型（一）隱性感染（inapparentorsubclinicalinfection）非顯性感染、亞臨床感染病毒侵入機(jī)體內(nèi)，不引起臨床癥狀的感染

形成原因：病毒毒力弱、機(jī)體防御較強(qiáng)，病毒不能大量增殖，未造成細(xì)胞、組織嚴(yán)重?fù)p傷；或最終不能侵入靶細(xì)胞。意義：獲得免疫力；（二）顯性感染（apparentinfection）病毒感染后，患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀可表現(xiàn)為局部和全身感染；1、急性感染：潛伏期短，發(fā)病急，病程短，恢復(fù)后病毒被徹底清除，機(jī)體獲得免疫力。如流感，甲肝等。2、持續(xù)性感染（persistentinfection）：

病毒在體內(nèi)持續(xù)存在幾個(gè)月,幾年,幾十年，甚至終身攜帶，經(jīng)常/反復(fù)有病毒排除體外，但缺乏持續(xù)性的臨床表現(xiàn)。病毒能持續(xù)存在于體內(nèi)的原因病毒Ag弱，不足以引起機(jī)體免疫反應(yīng)；病毒Ag變異，機(jī)體免疫系統(tǒng)不能有效識(shí)別；病毒基因整合在宿主細(xì)胞染色體上，病毒與細(xì)胞共存；病毒直接侵犯免疫細(xì)胞，造成免疫功能下降;

1、慢性感染（chronicinfection）顯性、隱性感染后，病毒未完全清除，持續(xù)存在血液或組織中，處于持續(xù)增殖狀態(tài)，并不斷排出體外。臨床癥狀可有、可無(wú)。病程長(zhǎng)（數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年），病毒慢性進(jìn)行性損傷機(jī)體，并能檢出病毒的存在。2、潛伏感染（latentinfection）顯、隱性感染后，病毒存在于一定組織或細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)生感染性病毒體。在某些條件下，病毒基因被激活而急性發(fā)作，增殖出病毒顆粒，出現(xiàn)顯性感染。3、慢發(fā)病毒感染（slowvirusinfection）又稱(chēng)遲發(fā)病毒感染（delayinfection）;

病毒感染后，在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期潛伏(數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年)后，出現(xiàn)慢性進(jìn)行性疾病，最終導(dǎo)致死亡;

常見(jiàn)病毒引起：

HIV→AIDS;

麻疹病毒→亞急性硬化性全腦炎（SSPE）

非常見(jiàn)病毒/待定致病因子引起：朊?！虬W疫(scrapie)，庫(kù)魯病(Kulu)等

病毒的致病機(jī)制（一）病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接作用1、殺細(xì)胞性感染

多見(jiàn)于裸露病毒機(jī)制：-阻斷細(xì)胞大分子合成；-破壞細(xì)胞溶酶體；-病毒毒性蛋白的作用；2、細(xì)胞膜的改變

細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，細(xì)胞功能受損。細(xì)胞膜表面出現(xiàn)新抗原病毒增殖，將自身蛋白表達(dá)在宿主細(xì)胞膜上，改變宿主細(xì)胞膜成分3、細(xì)胞轉(zhuǎn)化

某些病毒的DNA和宿主細(xì)胞的染色體整合，可使細(xì)胞遺傳性狀發(fā)生改變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生4、形成包涵體病毒感染C后，在光鏡下可見(jiàn)，胞漿或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸或嗜堿性的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為包涵體。形成機(jī)制：V顆粒的聚集；V增殖的場(chǎng)所；C對(duì)V的反應(yīng)產(chǎn)物；C表面的V-Ag細(xì)胞暴露的自身抗原

CELL體液免疫細(xì)胞免疫損傷宿主C

↓→

↗腎毛細(xì)血管基底膜→蛋白尿,血尿V-Ag+Ab→關(guān)節(jié)滑膜→關(guān)節(jié)炎

↘肺部→支氣管炎、肺炎

A.B.IC→（二）病毒感染的免疫病理?yè)p傷1、體液免疫損傷（II,III型超敏反應(yīng)）受染細(xì)胞表面有V-Ag、IC沉積

→自身免疫2、細(xì)胞免疫損傷（IV型超敏反應(yīng)）3、直接損傷淋巴細(xì)胞或淋巴器官

如：HIV直接損傷CD4+T細(xì)胞（三）病毒的免疫逃逸通過(guò)編碼特異性抑制蛋白或形成合胞體是病毒在細(xì)胞間傳播。第二節(jié)宿主的抗病毒免疫一、非特異性免疫：IFN,NK細(xì)胞（一）、干擾素(Interferon,IFN)

1、定義：病毒或干擾素誘生劑刺激機(jī)體的多種細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、體細(xì)胞等)，產(chǎn)生的抑制病毒增殖的糖蛋白。2、分類(lèi):

IFN類(lèi)型 主要來(lái)源 特點(diǎn)

I型 αIFN 人WBC

βIFN 人成纖維C

抑制病毒作用I>II

II型γIFN TC抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用II>I

IFN→細(xì)胞基因→抗病毒蛋白↓自身和鄰近細(xì)胞 降解病毒mRNA抑制病毒蛋白合成抑制病毒組裝、釋放↓抑制病毒復(fù)制↓中斷病毒感染；限制病毒擴(kuò)散

3、作用機(jī)理不是直接殺滅病毒4、生物學(xué)活性:（1）、廣譜的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在體內(nèi)擴(kuò)散、促進(jìn)痊愈;（2）、調(diào)節(jié)免疫功能；（3）、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；（二）NK：非特異性殺傷病毒感染的靶細(xì)胞

特點(diǎn)：不受MHC限制、不依賴Ab；可通過(guò)多種途徑活化；殺傷機(jī)制：NK→接觸靶C→釋放穿孔素、TNF→破壞受染C（一）、體液免疫：中和病毒（二）、細(xì)胞免疫：主要靠TC釋放穿孔素、顆粒酶，致敏TH1釋放的多種淋巴因子發(fā)揮作用二、特異性免疫

第三十三章病毒學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)一、標(biāo)本采集與送檢：原則：盡早采取、部位適宜、冷藏速送：冰塊或干冰、50%的甘油緩沖鹽水、抗生素雙份血清標(biāo)本：急性期、恢復(fù)期雙份血清二、快速檢查方法光鏡-----包涵體電鏡免疫熒光ELISA分子生物學(xué)技術(shù)雜交SouthernblotPCRNorthernblot三、病毒的分離培養(yǎng)檢驗(yàn)標(biāo)本→殺滅雜菌(青鏈霉素)接種病毒分離的一般程序：動(dòng)物接種→出現(xiàn)病狀雞胚接種→病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)→細(xì)胞病變

鑒定病毒種型

第三十四章

呼吸道病毒1.掌握呼吸道病毒的種類(lèi)和致病特點(diǎn)；流行性感冒病毒、SARS冠狀病毒、禽流感病毒、副黏病毒科病毒的生物特性和微生物檢驗(yàn)。2.熟悉流行性感冒病毒、SARS冠狀病毒、禽流感病毒、副粘病毒科病毒的臨床意義。3.了解其他呼吸道病毒的生物特性、臨床意義和微生物檢驗(yàn)。教學(xué)目的與要求呼吸道病毒是指一大類(lèi)能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為入侵門(mén)戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上的急性呼吸道感染由該類(lèi)病毒引起。呼吸道病毒引起的主要疾病呼吸道病毒流行性感冒病毒禽流感病毒副粘病毒科其它呼吸道病毒第一節(jié)正粘病毒科

一、流行性感冒病毒（influenzavirus）（一）分類(lèi)據(jù)RNP和M蛋白抗原性分：甲、乙、丙三型甲型根據(jù)HA和NA抗原性不同，又分若干亞型

（H1~H16、N1~N9）乙型、丙型至今未發(fā)現(xiàn)亞型（二）臨床意義“流行性感冒”（Influenza）是英國(guó)人Johnhuzxam在1743年創(chuàng)造的字，他依據(jù)意大利語(yǔ)中用來(lái)描述這個(gè)疾病起源的片語(yǔ)“uninfuenzadifreddo”，即“寒冷的影響”。它主要發(fā)生在深秋、冬天和早春季節(jié)。每年都有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人群受到感染。50年代以來(lái)共三次

1957年，H2N2，貴州1968年，H3N2，香港1977年，H1N1，遼寧先集體，后散居先城市，后農(nóng)村傳染源：顯、隱性患者、感染的動(dòng)物傳播途徑：呼吸道飛沫傳播

V→呼吸道粘膜柱狀上皮C→病變壞死→粘膜充血、水腫→炎癥↓↓ ↓鼻塞、咽喉腫痛、咳嗽、卡他等癥狀 毒性代謝產(chǎn)物（局部癥狀）↓入血 發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、乏力等（全身癥狀）V不入血，只在呼吸道上皮局部增殖（三）生物學(xué)特性1、形態(tài)結(jié)構(gòu)：流感病毒呈球形或絲狀，球形直徑80-120nm，新分離株絲狀多于球形,有包膜，單鏈分片段的RNA病毒。

流感病毒結(jié)構(gòu)表面：血凝素(HA)柱狀，為三聚體，基本上以相同的間距覆蓋了病毒的全部表面HA1（吸附）HA2（核衣殼釋放）血凝抑制抗體(保護(hù)性抗體)神經(jīng)氨酸酶（NA）四個(gè)亞單位組成的四聚體，并不平均分布在病毒表面，而是聚合成群。與病毒釋放有關(guān)。內(nèi)部：1、核衣殼病毒分片段的RNA，結(jié)合有核蛋白（NP）以及與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的三種依賴RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋對(duì)稱(chēng)。2、基質(zhì)蛋白（M蛋白）覆蓋在核衣殼外面，M蛋白抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性。M1(增加包膜厚度)M2(輔助HA2釋放核衣殼)3、包膜來(lái)自宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜。

流感病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)1、核衣殼病毒分片段的RNA，結(jié)合有核蛋白（NP）以及與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的三種依賴RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋對(duì)稱(chēng)。2、基質(zhì)蛋白（M蛋白）覆蓋在核衣殼外面，M蛋白抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性。M1(增加包膜厚度)M2(輔助HA2釋放核衣殼)3、包膜來(lái)自宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜。NAHA包膜M2M1基質(zhì)蛋白41235678核衣殼RNA核蛋白R(shí)NA聚合酶2、變異抗原漂移（antigenicdrift）因HA或NA的點(diǎn)突變?cè)斐桑儺惙刃?，屬量變，引起局部中、小型流行?？乖D(zhuǎn)換（antigenicshift）因HA或NA的大幅度變異造成，屬質(zhì)變，導(dǎo)致新亞型的出現(xiàn)，引起世界性的暴發(fā)流行。3、培養(yǎng)特性雞胚培養(yǎng)：不引起雞胚出現(xiàn)病變，取羊水或尿囊液做血凝試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)：紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)4、抵抗力較弱，不耐熱，對(duì)干燥、乙醚、甲醛和乳酸等敏感。微生物檢驗(yàn)病毒分離培養(yǎng)(金標(biāo)準(zhǔn))

取患者咽漱液或鼻咽拭，接種雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞抗原檢測(cè)直接從病人呼吸道分泌物、脫落細(xì)胞中檢測(cè)抗原分型鑒定

核酸雜交、PCR、序列分析血清學(xué)診斷

血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫測(cè)定二、禽流感病毒（一）臨床意義截止2013年5月11日，全國(guó)內(nèi)地共報(bào)告人感染H7N9禽流感確診病例130例，其中死亡人數(shù)33人，康復(fù)人數(shù)45人。病例分布于北京（1例）、上海（33例，死亡14例）、江蘇（27例，死亡8例）、浙江（46例，死亡7例）、安徽（4例，死亡2例）、福建（5例）、江西（5例，死亡1例）、山東（2例）、河南（4例，死亡1例）、湖南（2例）10省市的39個(gè)地市。另有臺(tái)灣1例。尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的證據(jù)。H7N9（二）生物學(xué)特性類(lèi)似流行性感冒病毒（三）微生物檢驗(yàn)標(biāo)本采集與處理：常規(guī)采集全血、死亡動(dòng)物腸內(nèi)容物、肛門(mén)拭子、氣管、肺、腸、脾、腎、腦、肝和心臟標(biāo)本。分離培養(yǎng)：雞胚培養(yǎng)法病毒抗原及抗體檢測(cè)：熒光免疫技術(shù)和酶免疫技術(shù)核酸檢測(cè)：PCR和RT-PCR第二節(jié)副黏病毒科

特點(diǎn)：①病毒體較大;

②具另一種刺突(F蛋白);

③單鏈RNA,不分節(jié)段。種類(lèi)：麻疹病毒腮腺炎病毒副流感病毒呼吸道合胞病毒

間質(zhì)性肺炎病毒

一、麻疹病毒入侵（CD46為病毒受體）呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)增殖入血（第一次病毒血癥）侵入淋巴組織和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)增殖后再次入血（第二次病毒血癥）多種組織、器官受累，表現(xiàn)為細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞，核內(nèi)形成嗜酸性包涵體等（一）臨床意義麻疹的臨床表現(xiàn)潛伏期約10~12天體溫略高、咳嗽、流涕、好打噴嚏及淚眼，癥狀持續(xù)3~5天體溫突然升高（達(dá)到40~40.5C），口頰粘膜出現(xiàn)柯氏斑，隨后出現(xiàn)紅色班丘疹，從