凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座

凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第1頁【目標要求】1、熟悉凝膠色譜分離基本原理；2、掌握凝膠柱色譜填充物裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第2頁【試驗原理】凝膠色譜是利用一些凝膠對于不一樣組分因分子大小不一樣而阻滯作用不一樣差異而進行分離技術。當溶液在色譜柱內(nèi)流過時，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時進行向下移動和不定向分子擴散運動。大分子物質(zhì)因為分子直徑大，難于進入凝膠顆粒微孔，只能在凝膠顆粒間隙中隨流動相快速向下移動；而小分子物質(zhì)能夠擴散進入凝膠顆粒微孔中，所以在流動過程中不停地進出于膠粒微孔，這么就使小分子物質(zhì)向下移動速度落后于大分子物質(zhì)，從而使溶液中各組分按分子量從大到小次序先后流出眾譜柱，到達分離純化目標。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第3頁【試驗用具】1、材料葡聚糖凝膠SephadexG-100、藍色葡聚糖、溶菌酶2、試劑（1）藍色葡聚糖-（2mg/mL）和溶菌酶（6mg/mL）組成混合液（2）0.025MKCl-0.2M乙酸緩沖液3、器具色譜柱、鐵架臺、試管、紫外分光光度計或紫外檢測儀、電爐、容量瓶、燒杯、三角瓶、滴管、移液管、玻棒。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第4頁【試驗過程】凝膠溶脹：依據(jù)預計總床體積和所用干膠床體積，稱出所需干凝膠放入大三角瓶或燒杯中，加入過量緩沖溶液或去離子水，浸泡24h以上或沸水浴中煮沸溶脹2~3h，冷卻至室溫。用傾瀉法將不易沉下較細顆粒傾去。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第5頁1、凝膠柱制備。裝柱：升高或關閉色譜柱出水口，在柱內(nèi)先注入約1/3柱高緩沖液。輕輕攪動三角瓶中凝膠（切勿攪動太快，以免空氣進入），使之形成均一凝膠漿，并馬上遲緩并連續(xù)不停地沿玻棒倒入柱中，讓其沉降約1~2cm高時，然后降低或打開柱出水口，讓緩沖液慢慢地流出。伴隨下面水流出，上面陸續(xù)不停地添加凝膠，直至凝膠完全沉降至所需柱高為止，然后在凝膠表面上放一片濾紙，以防未來在加樣時凝膠被沖起。柱要一次裝完，不能間歇，并一直保持凝膠上端有一段液體。層析分離系統(tǒng)凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第6頁2、平衡：用0.025MKCl-0.2M乙酸緩沖液流動平衡凝膠色譜柱。開始時，流速控制在低于0.5mL/min，在平衡過程中逐步增加到色譜時速度即3~4mL/5min，普通用約2~3倍總床體積緩沖溶液流過柱即可平衡。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第7頁3、加樣：吸去柱床表面以上溶液，面上留下一些液體從柱出口流出。等到凝膠床面上液體恰好流干時，小心地用滴管將約1mL藍色葡聚糖和溶菌酶混合液加到凝膠床面上。先使滴管尖端接觸離柱床表面約1cm高處內(nèi)壁，隨加隨沿柱內(nèi)壁轉(zhuǎn)動一周，然后快速移至中央，使樣品盡可能快地覆蓋住全膠面，打開下口，方便使樣品均勻地滲透柱內(nèi)，當樣品液下降至與膠面相平（膠面必須覆蓋一層薄薄溶液）時，關閉下口。待其恰好流干時再加少許緩沖溶液，這么滴入洗脫液時不會沖動凝膠床面。加樣前，假如膠面不平整，可用玻棒將膠表層輕輕攪起，待其自然沉降至平整后，方可加樣，加樣過程中注意不要破壞膠面平整。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第8頁4、洗脫：用0.025MKCl-0.2M乙酸緩沖液進行洗脫。流速控制在0.25mL/min。每15分鐘搜集一管，然后用紫外分光光度計于280nm處測定每管吸光度（A280）。洗脫過程中要注意觀察藍色區(qū)帶向下移動情況，如前沿平齊，區(qū)帶均勻，說明柱是均勻，能夠使用。如不均一，必須重新裝柱。以管號（或洗脫體積）為橫坐標，吸光度為縱坐標作出洗脫曲線，并分辨藍色葡聚糖-和溶菌酶洗脫峰或洗脫位置。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第9頁【注意事項】1、色譜柱大小可依據(jù)實際需要選擇，普通來說，細長柱分離效果很好。若樣品量多，最好選取內(nèi)徑較粗柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生管壁效應，即柱管中心部分組分移動慢，而管壁周圍移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，試驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。2、裝好色譜柱凝膠要均勻，不能有斷層或紋路或氣泡，將柱管對著光照方向觀察，若色譜柱床不均勻，必須重新裝柱。凝膠柱色譜分離蛋白質(zhì)專家講座第10頁3、各接頭不能漏氣，連接用小乳膠管不要有破損，不然造成漏氣、漏液。操作過程中，色譜柱內(nèi)液面不停下降，則表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應仔細檢驗并加以糾正。4、一直保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，不然水分揮發(fā)，凝膠變干。也要預防液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)流動，造成分離效果變差，不得不重新裝柱。5、洗脫用液體應與凝膠溶脹所用液體相同，不然，因為更換溶劑引發(fā)凝膠容積改變，從而影響分離效果凝膠柱色譜