第十二章熒光分析法課件

熒光分析的基本原理熒光定量分析方法熒光分析儀器與技術熒光分析法熒光分析的基本原理熒光分析法熒光分析法概述光致發(fā)光：吸收某種波長的光后發(fā)射出比吸收波長更長的光的現(xiàn)象。熒光分析法

(fluorormetry)熒光光譜→定性分析熒光強度→定量分析熒光分析的分類分析對象激發(fā)光波長范圍(熒光和磷光)原子熒光分析分子熒光分析

紫外-可見熒光分析紅外熒光分析X射線熒光分析熒光分析法概述光致發(fā)光：吸收某種波長的光后發(fā)射出比吸收波長更熒光分析法與紫外-可見分光光度法的主要區(qū)別紫外光I0IA∝CF(S=10-9~10-12g/ml)樣品溶液UV-vis(S=10-6~10-7g/ml)F∝C熒光分析法熒光分析法概述（續(xù)前）平行于入射光垂直于入射光優(yōu)點：靈敏度高（吸收）（發(fā)射）熒光分析法與紫外-可見分光光度法的主要區(qū)別紫外光I0IA∝C熒光分析法的基本原理分子熒光的產(chǎn)生原理熒光物質(zhì)分子的光譜特征熒光強度及其影響因素熒光分析法的基本原理分子熒光的產(chǎn)生原理單重態(tài)與三重態(tài)單重態(tài)(sigletstate,S)：總自旋量子數(shù)s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1基態(tài)(S0)三重態(tài)(tripletstate,T)：

s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3激發(fā)單重態(tài)(S)激發(fā)三重態(tài)(T)單重態(tài)與三重態(tài)單重態(tài)(sigletstate,S)：基態(tài)(激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑

振動弛豫(vibrationalrelexation)內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換(internalconversion)熒光(fluorescence)發(fā)射外部能量轉(zhuǎn)換(externalconversion)體系間跨越(intersystemcrossing)磷光發(fā)射激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑振動弛豫(vibrational激發(fā)態(tài)→基態(tài)途徑（圖）吸收基態(tài)(S0)第二電子激發(fā)單重態(tài)(S2*)第一電子激發(fā)三重態(tài)(T1*)振動弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換熒光外轉(zhuǎn)換體系間跨越磷光第一電子激發(fā)單重態(tài)(S1*)S1*(V=0)激發(fā)態(tài)→基態(tài)途徑（圖）吸收基態(tài)(S0)第二電子激發(fā)單重態(tài)(S振動弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非輻射~10-12s內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換）激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑（續(xù)前）S1*(V=n)S2*(V=0)非輻射E很小熒光發(fā)射

S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫輻射熒光：物質(zhì)分子接受光能激發(fā)后，從第一電子激發(fā)態(tài)最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光。振動弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非輻射~10-12s外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞轉(zhuǎn)移能量熱平衡過程S1*(V=0)T1*(V=n)非輻射激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑（續(xù)前）磷光發(fā)射

體系間跨越體系間跨越

S1*(V=0)振動馳豫Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換S0(V=n)輻射T1*(V=0)（10-4~10s）T1*(V=n)振動弛豫T1*(V=n)S1*(V=0)非輻射外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞轉(zhuǎn)移熒光和磷光的主要區(qū)別發(fā)光機制實驗現(xiàn)象熒光磷光單重態(tài)→單重態(tài)激發(fā)光停止照射→熒光立即消失三重態(tài)→單重態(tài)激發(fā)光停止照射→磷光仍將延續(xù)一段時間熒光和磷光的主要區(qū)別發(fā)光機制實驗現(xiàn)象熒光磷光單重態(tài)→單重態(tài)激激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長發(fā)射波長——熒光物質(zhì)分子的兩個特征光譜激發(fā)光譜(excitationspectrum)：

F~

ex

熒光光譜(fluorescencespectrum)：

F~

em激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長發(fā)射波長——熒光物質(zhì)分子的硫酸奎寧的激發(fā)光譜及熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜硫酸奎寧的激發(fā)光譜及熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜熒光光譜的特征斯托克斯位移(Stokesshift)

熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光波長（能量損失）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關

激發(fā)：S0(V=0)→Sn*(V=n)熒光：S1*(V=0)→S0(V=n)S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫輻射

熒光光譜的特征斯托克斯位移(Stokesshift)熒光熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關系蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜（實線）熒光光譜

S0→S2*激發(fā)光譜S0→S1*激發(fā)光譜熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關系蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜激發(fā)光譜：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)熒光光譜：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)

蒽的能級躍遷熒光光譜的特征（續(xù)前）激發(fā)光譜：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)蒽的能熒光壽命和熒光效率

熒光壽命(fluorescencelifttime,

f)：當激發(fā)光停止照射時，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的1/e所需的時間?！獰晒馕镔|(zhì)的兩個重要發(fā)光參數(shù)指數(shù)衰減定律：Ft=F0e-Kt

(K：衰減常數(shù))

t=

f→Ft=(1/e)F0

Ft/F0-t作圖→直線斜率=1/

f→

f

=1/斜率熒光壽命和熒光效率熒光壽命(fluorescenceli熒光效率(fluorescenceefficiency)

熒光量子產(chǎn)率(fluorescencequantumyield)物質(zhì)

f溶劑熒光素鈉0.92水熒光素0.65水蒽0.30乙醇菲1.00乙醇熒光效率(fluorescenceefficiency)

物質(zhì)分子能發(fā)射熒光的兩個必要條件有強的紫外-可見吸收有一定的熒光效率n→

*

→

*共軛雙鍵，K帶強吸收，熒光效率高，熒光強度強。弱吸收，體系間跨越幾率大，熒光較弱，意義不大。物質(zhì)分子能發(fā)射熒光的兩個必要條件有強的紫外-可見吸收n→有機化合物分子結構與熒光的關系長共軛結構（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)）共軛系統(tǒng)↑→

f↑→

ex、

em↑有機化合物分子結構與熒光的關系長共軛結構（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)

ex=327nm，

em=510nm稠芳環(huán)分子的幾何排列對熒光的影響含有長共軛雙鍵的脂肪烴

ex=327nm，em=510nm稠芳環(huán)分子的幾何排分子的剛性和共平面性共軛系統(tǒng)的剛性和共平面性↑→

f↑聯(lián)苯

f=0.2芴

f=1.0分子的剛性和共平面性共軛系統(tǒng)的剛性和共平面性↑→f↑金屬離子絡合增加分子剛性和共平面性8-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂位阻效應和立體效應→

f↓1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽

f=0.75

f=0.03位阻效應金屬離子絡合增加分子剛性和共平面性取代基供電子基：

–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN

→

f

↑，F(xiàn)↑吸電子基：

-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X→

f

↓，F(xiàn)↓，甚至熒光熄滅-R、-SO3H、-NH3+→對

f

無影響

取代基供電子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-C影響熒光強度的外界因素溫度T↓→F↑溶劑極性↑→

f↑→F↑→↑粘度↓→分子間碰撞幾率↑→F↓含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓形成氫鍵→S1*(V=0)分子↓→F↓pH值pH<2pH7~12pH>13弱酸、弱堿蘭色熒光影響熒光強度的外界因素溫度T↓→F↑溶劑極性↑→f↑→F↑熒光熄滅劑熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強度降低或熒光強度與濃度不呈線性關系的現(xiàn)象。熒光熄滅劑(quenchingmedium)：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。熒光熄滅劑熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或引起熒光熄滅的原因碰撞→損失能量作用→不發(fā)光物質(zhì)重原子Br/I→體系間跨越→三重態(tài)溶解O2→熒光物質(zhì)氧化/O2順磁性→體系間跨越→三重態(tài)熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度超過1g/L時，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。(濃度限量1

g~1mg/ml)熒光熄滅法(fluorescencequenchingmethod)：利用熒光物質(zhì)熒光強度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關系測定熒光熄滅劑含量的方法。引起熒光熄滅的原因碰撞→損失能量熒光熄滅法(fluoresc種類瑞利光(Reyleighscatteringlight)：彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅改變光子運動方向，波長及頻率不變。拉曼光(Ramanscatteringlight)：非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子的運動方向和波長、頻率均發(fā)生改變。較長拉曼光干擾熒光測定。散射光散射光(scatteringlight)：由于光子與物質(zhì)分子相互碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射。種類較長拉曼光干擾熒光測定。散射光散射光(scatterin硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜拉曼光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜熒光定量分析熒光定量分析的依據(jù)——F與C的關系熒光定量分析方法熒光分析法與UV-vis定量分析的區(qū)別熒光定量分析熒光定量分析的依據(jù)——F與C的關系熒光強度F與濃度C的關系溶液的熒光測定激發(fā)光源垂直方向熒光測定方向：激發(fā)光源垂直方向，避免透射光干擾。F=K

(I0–I)

(I=I010-ECl)

=K

(I0-I010-ECl)=K

I0(1-10-ECl)=K

I0(1-e-2.3ECl)太勞極數(shù)展開式：ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+……

熒光強度F與濃度C的關系溶液的熒光測定激發(fā)光源垂直方向熒光測ECl≤0.05F=2.3K

I0ECl=KC熒光分析法僅適用于稀溶液的測定滿足定量分析條件：ECl≤0.05→F∝C降低熒光自熄滅（內(nèi)部猝滅）作用靈敏度高（放大信號）F與C的關系推導（續(xù)前）熒光定量分析的依據(jù)

ECl≤0.05F=2.3KI0ECl=KC熒光分析法僅熒光分析法與UV-vis靈敏度差異紫外-可見分光光度法定量依據(jù)：A∝C

檢測信號：A=-lg(I/I0)=ECl

C↓→I0/I≈1→A≈0

熒光分析法定量依據(jù)：F∝I0及C

檢測信號：F=2.3K

I0ECl

C↓→F↓→放大信號（檢測靈敏度↑）→I0↑→F↑→熒光分析靈敏度高→放大信號→I0↑，I↑→I/I0不變→UV-vis靈敏度受限，不如熒光分析(S=10-6~10-7g/ml)(S=10-9~10-12g/ml)

熒光分析法與UV-vis靈敏度差異紫外-可見分光光度法定量依熒光定量分析方法校正曲線法(F~C)

熒光分析法與UV-vis定量測定時儀器校正的區(qū)別0100%UV-vis熒光分析法T=0，A=∞關閉光閘，光不透過，全吸收T=100%，A=0空白溶液，光全透過，不吸收F=0空白溶液，不發(fā)射熒光F=100%對照品溶液CmaxF=50%(Cmid)熒光定量分析方法校正曲線法(F~C)熒光分析法與UV-vi比例法熒光定量分析方法（續(xù)前）適用：校正曲線過原點多組分混合物測定

原理：熒光強度的加和性方法：解聯(lián)立方程空白調(diào)零降低測定的靈敏度：儀器調(diào)零→F0→Fs和Fx→扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)計算。比例法熒光定量分析方法（續(xù)前）適用：校正曲線過原點多組分混合熒光分析儀器與技術熒光分析儀器類型、主要部件和校正熒光分析新技術熒光分析的應用熒光分析儀器與技術熒光分析儀器類型、主要部件和校正熒光分析儀器類型濾光片熒光計分光系統(tǒng)：激發(fā)濾光片（帶通型）發(fā)射濾光片（截止型）用途：可用于定量分析；不能測定光譜濾光片-單色器熒光計分光系統(tǒng)：激發(fā)濾光片+發(fā)射光柵用途：可用于測定熒光光譜及定量分析；不能測定激發(fā)光譜，

熒光分析儀器類型濾光片熒光計濾光片-單色器熒光計930型熒光計光路示意圖激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片熒光分析儀器類型（續(xù)前）

930型熒光計光路示意圖激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片熒光分析儀器類型熒光分光光度計熒光分光光度計結構示意圖分光系統(tǒng)：光柵用途：測定激發(fā)光譜、熒光光譜及定量分析。最大激發(fā)波長

exmax和最大熒光波長

emmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)和定量測定時最靈敏的條件。激發(fā)單色器發(fā)射單色器熒光分析儀器類型（續(xù)前）熒光分光光度計熒光分光光度計結構示意圖分光系統(tǒng)：光柵最大激發(fā)熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：汞燈、氙燈、氘燈、溴鎢燈分光系統(tǒng)：濾光片；單色器（光柵）樣器池：低熒光材料或石英材料，四面透光檢測器：紫外-可見（光電倍增管）熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：汞燈、氙燈、氘燈、溴鎢燈熒光分析儀器的校正靈敏度校正：對照品溶液Cmax→F=100%

Cmid→F=50%

硫酸喹啉:0.001g喹啉標準品→硫酸(0.05mol/L)→C=1

g/ml波長校正：汞燈標準譜線激發(fā)光譜與熒光光譜的校正單光束：調(diào)整光源強度一致雙光束：參比光束抵消光學誤差熒光分析儀器的校正靈敏度校正：對照品溶液Cmax→F=10熒光分光光度計與紫外分光光度計的區(qū)別

紫外-可見分光光度計熒光分光光度計光路光源儀器校正吸收池入射光與吸收光同方向入射光與熒光垂直方向兩種光源(紫外+可見)一種光源(紫外)空白溶液(F=0)熒光對照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外無吸收兩面透光低熒光材料四面透光熒光分光光度計與紫外分光光度計的區(qū)別紫外-可見分光光度計熒熒光分析新技術激光熒光分析時間分辨熒光分析(time-resolvedfluorometry)原理：激發(fā)和檢測之間延緩一段時間，具有不同熒光壽命的物質(zhì)分別檢測激發(fā)光源：脈沖激光優(yōu)點：檢測時排除干擾，無需化學預處理激發(fā)光源：波長更短、強度更大的激光優(yōu)點：提高靈敏度(樣品量<1

l或10-16~10-14g)和專一性用途：生化樣品、氣體樣品及有機化合物的自由基熒光分析新技術激光熒光分析時間分辨熒光分析(time-res同步熒光分析原理：

=

exmax-

emmax→同步熒光光譜→

同步信號Fsp(

ex,

em)=KCFexFem用途：多核芳香族化合物熒光分析新技術（續(xù)前）膠束增敏熒光分析原理：膠束溶液的增溶、增穩(wěn)、增敏作用優(yōu)點：提高熒光物質(zhì)溶解度、穩(wěn)定性及靈敏度膠束溶液：一定濃度(>臨界膠束濃度CMC)的表面活性劑溶液親水基疏水基同步熒光分析原理：=exmax-emmax→同步熒光熒光分析的應用有機化合物的熒光分析研究對象：芳香族及具有芳香結構的化合物有機化合物：多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結構的氨基酸類及蛋白質(zhì)藥物：生物堿類(麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿)；甾體類(皮質(zhì)激素及雌醇)；抗生素類(青霉素、四環(huán)素)；維生素類(維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺)中草藥：有效成分（芳香性結構的大分子雜環(huán)類）熒光分析的應用有機化合物的熒光分析研究對象：芳香族及具有芳香熒光試劑熒光胺熒光條件：

ex=275