核酸的生物合成知識講座

核酸的生物合成知識講座核酸的生物合成知識講座第1頁第十二章核酸生物合成核酸的生物合成知識講座第2頁學習要求了解核苷酸生物合成代謝路徑及核苷酸生物合成機理。了解用核苷酸生物合成路徑篩選融合細胞原理。掌握核酸生物合成模板、原料、能源物質、合成方向、酶。搞清中心法則、復制、半保留復制、不連續(xù)復制、轉錄、反轉錄、岡崎片段、翻譯等概念。了解病毒分子結構及繁殖與致癌作用和核酸生物合成間關系。了解核酸合成抑制劑及作用原理。核酸的生物合成知識講座第3頁第十二章核酸生物合成12.1DNA生物合成DNA指導下DNA復制RNA指導下DNA復制DNA損傷和修復12.2RNA生物合成和加工12.3核酸病毒12.4核酸生物合成抑制劑核酸的生物合成知識講座第4頁12.1.1DNA指導下DNA復制分子遺傳中心法則半不連續(xù)復制原核細胞DNA復制半保留復制DNA復制起點和方向真核細胞DNA復制DNA復制普通特征DNA復制忠實性返回核酸的生物合成知識講座第5頁分子遺傳中心法則DNA是遺傳信息儲存和公布者，它在如圖聯絡中處于中心地位。核酸的生物合成知識講座第6頁分子遺傳中心法則中心法則幾個基礎概念復制：以親代DNA或RNA為模板，依據堿基配正確標準，在一系列酶作用下，生成與親代相同子代DNA或RNA過程。轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對標準合成RNA，即將DNA所含遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補RNA過程。翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA密碼解讀成蛋白質氨基酸次序過程。逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶作用下，生成DNA過程。返回核酸的生物合成知識講座第7頁半保留復制以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這么新形成子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成，這種復制方式叫半保留復制。核酸的生物合成知識講座第8頁半保留復制核酸的生物合成知識講座第9頁半保留復制Meselson和Stahl將同位素15N標識15NH4Cl加入大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌DNA都帶上15N標識，然后將該大腸桿菌轉入14N普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進行氯化銫密度梯度離心，試驗證實了DNA半保留復制。核酸的生物合成知識講座第10頁半保留復制返回核酸的生物合成知識講座第11頁DNA復制起點和方向(1)兩個起點，兩個生長端相向復制DNA每條鏈有1個復制起點，分別合成1條新DNA，兩條新鏈相向合成，每個生長點只有1條鏈合成，這種方式存在于線性DNA病毒。(2)1個起點，1個復制區(qū)單向復制DNA兩條鏈復制起始點在同一位置，復制向一個方向運動，兩條DNA鏈均被復制，這種方式偶見于一些環(huán)形DNA復制。(3)1個起點，兩個復制區(qū)雙向復制這種DNA復制方式最為普遍，復制起始于1個位點，形成兩個復制區(qū)向相反方向運動，在每個復制區(qū)兩條DNA鏈均被復制。核酸的生物合成知識講座第12頁DNA復制起點和方向返回核酸的生物合成知識講座第13頁半不連續(xù)復制DNA雙螺旋兩條鏈是反向平行，而合成方向只能是5’3’。所以在DNA復制時，1條鏈合成方向和復制叉前進方向相同，可連續(xù)復制，稱為前導鏈；而另一條鏈合成方向和復制叉前進方向恰好相反，不能連續(xù)復制，只能分成幾個片段合成，稱為滯后鏈。滯后鏈片段叫作岡崎片段，它們合成后再連接起來。返回核酸的生物合成知識講座第14頁原核細胞DNA復制(E.coli)模板：DNA引物：RNA原料、能源物質：NTP，dNTP酶：引物酶；DNA聚合酶I、II、III；DNA連接酶；解鏈酶；單鏈結合蛋白；拓撲異構酶合成方向：模板鏈3’—5’；合成鏈5’—3’核酸的生物合成知識講座第15頁大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞分子統計數5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/秒)功效DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復合物）103,000400+++16~20切除引物，修復88,000100++-40修復830,00010-20++-250~1000復制比較項目核酸的生物合成知識講座第16頁DNA聚合酶催化反應核酸的生物合成知識講座第17頁與DNA合成相關蛋白因子(E.coli)蛋白質功效相對分子量（×103）分子/細胞DNA旋轉酶(或拓撲異構酶)引入或松開超螺旋400DNA解鏈酶使雙鏈DNA解鏈6550單鏈結合蛋白穩(wěn)定單鏈區(qū)74300引物合成酶合成RNA引物60100DNA聚合酶Ⅰ除去引物并填滿缺口109300核酸的生物合成知識講座第18頁原核細胞DNA合成步驟解旋：由拓撲異構酶解除DNA超螺旋結構。解鏈：由解鏈酶使雙鏈DNA解開再由單鏈結合蛋白與單鏈結合，預防氫鍵再形成。識別起點：由DNA指導RNA聚合酶即引物酶完成。生成引物：以DNA為模板在引物酶催化下由DNA轉錄成。DNA生成：在RNA引物3’末端上按堿基互補標準經DNA聚合酶III催化生成，其3’末端與下一個RNA引物5’末端相連。核酸的生物合成知識講座第19頁原核細胞DNA合成步驟切除引物：由DNA聚合酶I催化切除引物，剩下DNA片段即岡崎片段。補齊封口：DNA聚合酶I利用其DNA聚合酶活性按堿基互補標準沿5’—3’方向填補兩個岡崎片段之間缺口。其3’末端羥基與下一個DNA片段5’末端相連磷酸基，在DNA連接酶催化下形成磷酸二酯鍵而被連結起來，最終形成DNA模板鏈完整新互補鏈，此部由NAD+供能。核酸的生物合成知識講座第20頁DNA合成起始與延伸拓撲異構酶解鏈酶引物酶前導鏈合成（DNA聚合酶III)

核酸的生物合成知識講座第21頁切除引物與補齊封口返回核酸的生物合成知識講座第22頁真核細胞DNA復制真核細胞與原核細胞DNA復制區(qū)分在于：RNA引物和岡崎片段較小。復制速度較慢，這可能與組蛋白存在使DNA處于穩(wěn)定雙股狀態(tài)相關。復制有多個起點。DNA聚合酶為α，β，γ以及線粒體聚合酶。它們僅能催化聚合作用，而沒有原核細胞DNA聚合酶全部外切酶作用。DNA片段連接由ATP供能。核酸的生物合成知識講座第23頁DNA聚合酶功效DNA聚合酶細胞定位功效α細胞核細胞核DNA復制β細胞核細胞核DNA修復γ細胞核細胞質線粒體酶線粒體線粒體DNA復制返回核酸的生物合成知識講座第24頁DNA復制忠實性DNA復制含有高度準確性，在大腸桿菌細胞DNA復制中錯誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個核苷酸才有一個錯誤。這么高準確性確保主要與以下原因相關：1、堿基配對規(guī)律：模板鏈與新生鏈之間堿基配對確保堿基配錯幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶3’→5’外切酶活性校對功效，使堿基錯配幾率又降低100～1000倍。3、DNA損傷修復系統核酸的生物合成知識講座第25頁DNA聚合酶自我校正DNA聚合酶不能從頭合成DNA，即不能把兩個dNTP連接起來，而只能將一個個核苷酸單位加到形成堿基配正確引物鏈3’羥基上，假如引物鏈3’羥基出現了和模板鏈錯配堿基，DNA聚合酶就會馬上停頓前進，并利用3’

5’核酸外切酶活性將錯配核苷酸從引物3’端切除，只有引物3’端重新出現堿基配對時才繼續(xù)合成DNA。所以在合成DNA之前必須有正確堿基配對存在于3’端，即DNA聚合酶必須利用RNA引物鏈來檢驗3’端堿基配對正確是否，在確認無誤后才開始合成。核酸的生物合成知識講座第26頁錯配校正系統錯配校正系統能發(fā)覺DNA雙螺旋因非互補堿基對間不對稱而產生變形，它能區(qū)分和切除存在于新合成DNA中錯配核苷酸。E.coli錯配校正系統利用dam基因編碼甲基化酶將DNA堿基序列中A在N6位甲基化，但新合成A要晚一些才被甲基化，這使堿基序列只是在剛合成新DNA鏈中還沒有被甲基化，這就能區(qū)分新DNA鏈和模板鏈。參加錯配修復酶與蛋白質：Dam甲基化酶；MutH、MutL、MutS蛋白；解螺旋酶Ⅱ；SSB；DNA聚合酶Ⅲ；外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶；DNA連接酶核酸的生物合成知識講座第27頁錯配校正系統返回核酸的生物合成知識講座第28頁12.1.2RNA指導下DNA復制(反轉錄)以RNA指導DNA聚合酶催化合成DNA是以dNTP為原料及能源物質，以病毒單鏈RNA為模板，RNA為引物。反應時模板與引物以氫鍵相連，在引物3’羥基末端開始以5’—3’方向進行DNA聚合、延伸。合成DNA以共價鍵相連，形成DNA-RNA雜合體。在DNA指導DNA聚合酶催化下以雜合體中DNA為模板合成一條DNA互補鏈，形成新DNA分子。核酸的生物合成知識講座第29頁12.1.2RNA指導下DNA復制(反轉錄)依賴RNADNA聚合酶核糖核酸酶H活性依賴DNADNA聚合酶核酸的生物合成知識講座第30頁12.1.2RNA指導下DNA復制(反轉錄)核酸的生物合成知識講座第31頁因發(fā)覺逆轉錄病毒遺傳物質而獲1975年諾貝爾獎三位科學家返回核酸的生物合成知識講座第32頁12.1.3DNA損傷和修復細胞內DNA可能因物理或化學原因而受到損傷，比如射線輻射、化學誘變劑和受熱等。另外，DNA復制產生誤差也可能造成DNA損傷。（一）DNA損傷表現類型（二）DNA損傷修復機制

返回核酸的生物合成知識講座第33頁DNA損傷表現類型堿基改變：水解造成堿基脫氨基作用可改變堿基配對。UV波長紫外線和放射性射線可造成DNA鏈中相鄰兩個同股或異股嘧啶堿基間發(fā)生共價交聯形成二聚體，在雙螺旋區(qū)產生變形，干擾了DNA復制，引發(fā)錯股合成造成細胞死亡。核酸的生物合成知識講座第34頁DNA損傷表現類型堿基丟失：因熱或酸破壞糖苷鍵能夠造成嘌呤堿基丟失，水解也能造成嘧啶堿基丟失。核苷酸插入或缺失：在DNA復制或重組時，嵌入劑可造成DNA核苷酸增加或降低。DNA鏈斷裂：電離輻射、自由基或一些化學試劑可使磷酸二酯鍵斷裂，產生3’-脫氧核酸片段。DNA鏈間共價交聯：含有兩個功效基團烷化劑，可使兩條DNA鏈間發(fā)生共價交聯。返回核酸的生物合成知識講座第35頁DNA損傷修復機制光復活可見光（400nm）能激活細胞內光復活酶、光裂合酶，它們可分解因紫外線照射而形成嘧啶二聚體。光復活酶分布廣泛，從單細胞生物到鳥類細胞都有之，但哺乳動物細胞缺乏這種酶。核酸的生物合成知識講座第36頁DNA損傷修復機制光復活機制核酸的生物合成知識講座第37頁DNA損傷修復機制切除修復——最為普遍切開：特異核酸內切酶識別損傷結構，并切斷損傷部位兩端磷酸二酯鍵。切除：特異酶或蛋白因子將損傷片段去除。合成：DNA聚合酶以單鏈區(qū)為模板合成互補拷貝以填補缺口，最終DNA連接酶將新合成DNA片段3’端和切口5’端連接起來。DNA損傷類型決定切除修復詳細方式和步驟，詳細可分為堿基切除修復和核苷酸切除修復2種方式。核酸的生物合成知識講座第38頁DNA損傷修復機制堿基切除修復（a）DNA糖基化酶切除損傷堿基產生無堿基酸（b）無堿基核酸內切酶在無堿基酸處切開產生切口（c）DNA聚合酶Ⅰ將無堿基酸切除并填補缺口（d）DNA連接酶連接切口核酸的生物合成知識講座第39頁DNA損傷修復機制核苷酸切除修復這種方式能夠修復DNA發(fā)生幾乎全部類型巨大損傷，包含一些與致癌劑共價結合堿基。核酸的生物合成知識講座第40頁DNA損傷修復機制重組修復受損傷DNA在進行復制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應部位出現缺口。經過分子間重組，從完整母鏈上將對應堿基次序片段移至子鏈缺口處，然后再用合成多核苷酸來補上母鏈空缺，此過程即重復修復。并非完全校正。核酸的生物合成知識講座第41頁DNA損傷修復機制SOS修復指DNA受到嚴重損傷、細胞處于危急狀態(tài)時所誘導一個DNA修復方式，修復結果只是能維持基因組完整性，提升細胞生成率，但留下錯誤較多，又稱傾錯性修復（Error-ProneRepair）。返回核酸的生物合成知識講座第42頁12.2RNA生物合成和加工在生物界，RNA合成有兩種方式：一是DNA指導RNA合成，此為生物體內主要合成方式。另一個是RNA指導RNA合成，此種方式常見于病毒。原核細胞RNA生物合成真核細胞RNA生物合成RNA指導RNA合成(RNA復制)DNA指導RNA合成(轉錄)返回核酸的生物合成知識講座第43頁原核細胞RNA生物合成1960年，RNA聚合酶被發(fā)覺。在E.coli中，RNA聚合酶催化RNA合成需要：模板：雙鏈或單鏈DNA活性單體物質：四種NTP二價金屬離子：Mg2+或Mn2+，在生物體中發(fā)覺是Mg2+合成方向：5’3’核酸的生物合成知識講座第44頁區(qū)分RNA與DNA合成RNA合成與DNA合成不一樣在于：轉錄不需要引物只轉錄DNA分子中一個片段(稱為操縱子operon)雙鏈DNA中只有一條鏈含有轉錄活性(稱為模板鏈)RNA聚合酶無校對功效核酸的生物合成知識講座第45頁不對稱轉錄模板鏈：雙鏈DNA中含有轉錄活性鏈稱為模板鏈，又稱反義鏈（或負鏈）。編碼鏈：雙鏈DNA中無轉錄活性鏈稱為編碼鏈，又稱有義鏈（或正鏈）。5′5′3′3′開啟子(promoter)終止子(terminator)模板鏈(templattestrand)反義鏈(antisensestrand)有義鏈(sensestrand)DNA核酸的生物合成知識講座第46頁RNA聚合酶(E.coli)由5種亞基α2ββ’

σ組成全酶；沒有σ、

亞基酶稱為關鍵酶，只催化鏈延長；σ稱為起始因子，能識別DNA鏈轉錄起始信號（稱為開啟子）。核酸的生物合成知識講座第47頁RNA聚合酶(E.coli)解螺旋恢復螺旋轉錄泡模板鏈編碼鏈核酸的生物合成知識講座第48頁RNA轉錄過程RNA轉錄由起始、延伸、終止三個階段組成。起始：RNA聚合酶在σ亞基引導下結合于開啟子；DNA雙鏈局部解開；在模板鏈上經過堿基配對合成最初RNA鏈延伸：關鍵酶沿著DNA鏈由3’→5’方向移動，轉錄區(qū)間DNA雙鏈解螺旋，而轉錄完區(qū)間DNA又恢復雙螺旋結構終止：關鍵酶抵達終止子，RNA與關鍵酶從DNA上脫落核酸的生物合成知識講座第49頁RNA轉錄起始核酸的生物合成知識講座第50頁RNA轉錄延伸核酸的生物合成知識講座第51頁RNA轉錄終止轉錄終止信號有兩種：弱終止子：依賴ρ因子終止，NusA蛋白識別DNA鏈上終止信號，在ρ因子幫助終止。強終止子：（1）在終止點之前含有一段富含G-C回文區(qū)域。（2）富含G-C區(qū)域之后是一連串dA堿基序列，它們轉錄RNA鏈末端為一連串U連續(xù)6個）。核酸的生物合成知識講座第52頁不依賴ρ因子終止子：

含富GC回文序列和寡聚U序列返回核酸的生物合成知識講座第53頁真核細胞RNA生物合成真核生物RNA聚合酶主要分布于細胞核內，RNA合成也就主要發(fā)生在細胞核中。酶類分布產物α-鵝膏蕈堿對酶影響分子量(KDa)反應條件ⅠⅡⅢ核仁核質核質rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制500～700～700低離子強度要求Mg2+或Mn2+高離子強度高Mn2+濃度核酸的生物合成知識講座第54頁RNA轉錄產物加工原核生物mRNA轉錄后普通不需要加工，轉錄同時即進行翻譯（半壽期短）。但在真核細胞內，由RNA聚合酶合成原始轉錄物往往需要一系列改變，包含鏈裂解、5’和3’末端切除和特殊結構形成、核苷修飾、以及拼接和編輯等過程，才轉變?yōu)槌墒霷NA分子。此過程總稱為RNA成熟或稱為RNA轉錄后加工。包含rRNA前體加工、tRNA前體加工、真核mRNA前體加工。核酸的生物合成知識講座第55頁rRNA前體加工加工過程：1、剪切作用：需核酸酶參加。

2、甲基化修飾：修飾在堿基上。

3、自我剪接：一個核酶作用。原核rRNA加工：rRNA含非轉錄間隔區(qū)，其產物中含tRNA真核rRNA加工：1.5S自成體系加工少，無修飾和剪接。

2.45S加工中含剪切和甲基化修飾，需核酸酶。核酸的生物合成知識講座第56頁rRNA前體加工甲基化核酸內切酶核酸外切酶核酸的生物合成知識講座第57頁rRNA前體加工核酸的生物合成知識講座第58頁tRNA前體加工包含：核酸外切酶從兩端向內切去多出序列；在3’-端加CCAOH序列；核苷酸修飾與異構化；核酸內切酶切除居間序列。核酸的生物合成知識講座第59頁真核mRNA前體加工hnRNA被剪接，把內含子（DNA上非編碼序列）轉錄序列剪掉，把外顯子（DNA上編碼序列）轉錄序列）拼接上，真核生物普通為不連續(xù)基因。3’端添加polyA“尾巴”。5’端連接“帽子”結構（m7G5

ppp5

NmpNp-）。分子內部核苷酸甲基化修飾。核酸的生物合成知識講座第60頁真核mRNA前體加工內含子外顯子核酸的生物合成知識講座第61頁因發(fā)覺斷裂基因而獲1993年諾貝爾生理學獎RichardJRobertandPhllipASharp返回核酸的生物合成知識講座第62頁RNA指導RNA合成概念：RNA病毒以本身RNA為模板合成與本身RNA完全相同RNA分子過程稱為RNA復制。兩個階段：（1）病毒RNA可充當mRNA，利用寄主中核糖體合成外殼蛋白和復制酶β亞基。（2）復制酶β亞基與來自宿主細胞亞基αγδ自動裝配成RNA復制酶，進行RNA復制，通常以分子中單鏈RNA為模板（正鏈），復制出一條新RNA鏈（負鏈），然后以負鏈為模板復制出大量正鏈，再與外殼蛋白組裝成新病毒顆粒。核酸的生物合成知識講座第63頁RNA指導RNA合成RNA復制酶催化性質：以四種NTP為底物；專一性地選擇病毒RNA為模板；按5’→3’方向合成病毒RNA；無外切酶活性（即無校對功效）核酸的生物合成知識講座第64頁病毒RNA復制方式1、病毒含正鏈RNA：進入宿主細胞后先進行病毒RNA復制酶和相關病毒蛋白質合成（借助于宿主細胞蛋白質合成體系），然后進行RNA復制，再裝配病毒顆粒。如：噬菌體Qβ和灰質炎病毒。2、病毒含負鏈RNA和復制酶：這類病毒進入宿主細胞后，先進行RNA復制合成正鏈RNA，再以正鏈RNA為模板合成病毒蛋白質RNA，然后裝配病毒顆粒。如：狂犬病病毒、馬水苞性口炎病毒。3、病毒含雙鏈RNA和復制酶：這類病毒進入宿主細胞后，以雙鏈RNA為模板，經過不對稱復制產生正鏈RNA，并以正鏈RNA為模板合成病毒蛋白質，然后再合成負鏈RNA并形成雙鏈RNA，再裝配病毒顆粒。如呼腸病毒。4、致癌RNA病毒：如后所述。返回核酸的生物合成知識講座第65頁12.3核酸病毒核酸生物合成普通規(guī)則DNA病毒RNA病毒病毒致癌說返回核酸的生物合成知識講座第66頁核酸生物合成普通規(guī)則絕大多數細胞DNA和RNA合成，都是按照Watson-Crick堿基互補標準，經過拷貝預先存在DNA鏈（模板鏈）來產生。核酸鏈合成方向只有一個：5’3’。特異聚合酶催化合成DNA或RNA。致癌DNA與RNA病毒繁殖與致癌作用是核酸生物合成詳細化。返回核酸的生物合成知識講座第67頁病毒致癌說19，F.P.Rous研究雞腫瘤時發(fā)覺，用濾紙濾掉細胞后液體可誘發(fā)其它雞癌變，提出病毒致癌說（1966年或諾貝爾醫(yī)學獎）1958年B.Dulbecco用乳頭瘤病毒SV40證實病毒感染正常細胞，能夠將自己遺傳物質整合入宿主細胞DNA中，從而在分子水平說明了病毒致癌說（1975年獲醫(yī)學諾貝爾獎）。返回核酸的生物合成知識講座第68頁DNA病毒正常細胞受到DNA腫瘤病毒感染后，發(fā)生染色體變異、永久性形態(tài)改變、失去接觸抑制、增殖加速、產生新抗原從而含有形成腫瘤能力。DNA病毒吸附于宿主細胞膜而進入細胞后，在細胞膜處脫去核殼蛋白，DNA進入細胞核中。其一個別或全部可整合于宿主細胞核DNA分子中，形成變異DNA。整合后DNA能夠完整分子形式一起復制，轉錄。它使宿主細胞發(fā)生一些特征性改變，最終轉化成腫瘤細胞。返回核酸的生物合成知識講座第69頁RNA病毒RNA病毒不含DNA，絕大多數病毒RNA是單鏈，而且都是線狀分子。RNA病毒中，RNA是其遺傳信息攜帶者，經過RNA復制，傳遞遺傳信息。通常病毒RNA復制過程包含:基因組RNA轉錄