植物細(xì)胞工程技術(shù)原理

主要內(nèi)容組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)組織培養(yǎng)技術(shù)操作影響組織培養(yǎng)效果的因素第一節(jié)組織培養(yǎng)技術(shù)操作組織培養(yǎng)技術(shù)流程？組織培養(yǎng)1選擇植物材料2培養(yǎng)基5培養(yǎng)(溫度控制等）4接種3滅菌一、培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的組成成分培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的配制1、培養(yǎng)基的組成成分最早風(fēng)眼蘭柵欄組織Knop溶液+蔗糖存活不分裂1934年White番茄根離體培養(yǎng)成功（1937年發(fā)現(xiàn)B族維生素的作用，創(chuàng)立White培養(yǎng)基）1948年Skoog和崔真煙草莖段培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可解除生長(zhǎng)素對(duì)芽生長(zhǎng)的抑制作用培養(yǎng)基的組成：水、無(wú)機(jī)鹽、糖、有機(jī)物、植物激素、其他添加物等。1、培養(yǎng)基的組成成分糖：碳源，維持培養(yǎng)基的滲透壓3%（2~6%）無(wú)機(jī)鹽：一般有10~20種，分為大量元素和微量元素兩類。大量元素：N、P、S、K、Ca、Mg微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo一種離子一般由一種以上的無(wú)機(jī)鹽提供，以保證離子平衡，避免由于培養(yǎng)物吸收差異引起的pH變動(dòng)。1、培養(yǎng)基的組成成分有機(jī)物：維生素類

VitB1（硫胺素）VitB6（鹽酸吡哆醇）VitB3（煙酸）VitB5（泛酸鈣）

肌醇

氨基酸

CH（水解酪蛋白）、LH（水解乳蛋白）

ME（麥芽提取物）、YE（酵母浸出物）1、培養(yǎng)基的組成成分植物激素：生長(zhǎng)素類：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化；IBA、IAA、NAA、2,4-D

0.1mol/L的NaOH配制細(xì)胞分裂素類：促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化不定芽6-BA、KT、ZA、2iP

0.5或1mol/L的HCl配制1、培養(yǎng)基的組成成分其他添加成分：固化劑（gellingagent）：瓊脂用量一般為7-10g/L，即0.7-1%（W/V）太大，培養(yǎng)基過(guò)硬；太小，培養(yǎng)基不易凝固。吸附劑：活性碳，適用于培養(yǎng)中容易形成不利于生長(zhǎng)的分泌物的培養(yǎng)物。pH變動(dòng)高中化學(xué)：無(wú)機(jī)鹽溶液酸堿性的判斷依據(jù)是，該鹽是否發(fā)生水解。強(qiáng)酸強(qiáng)堿鹽如NaCl中性；強(qiáng)酸弱堿鹽如NH4Cl酸性；強(qiáng)堿弱酸鹽如Na2CO3堿性。大學(xué)：植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收是以離子形式進(jìn)行的，以交換吸附方式發(fā)生，陽(yáng)離子和H+發(fā)生交換吸附；陰離子和HCO3-13種必需礦質(zhì)元素的吸收量存在如下關(guān)系：大量元素：N＞K＞Ca＞Mg=P＞S；微量元素：Cl=Fe＞Mn＞B＞Zn＞Cu=Mo(NH4)2SO4中，吸收量N＞S，培養(yǎng)基中H+多，生理酸性鹽，pH減小KNO3中，N＞K，HCO3-多，生理堿性鹽，pH增大。2、培養(yǎng)基的分類按性質(zhì)分：基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基加激素按狀態(tài)分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2、培養(yǎng)基的分類基本培養(yǎng)基按照組成成分又可分為很多種，常見的如MS、Miller、B5、N6、T、LS、H、KM8P等。根據(jù)其鹽濃度大致可分為四類：富鹽平衡培養(yǎng)基：MS高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：B5、N6中鹽培養(yǎng)基：Miller，大量元素濃度為MS的一半低鹽培養(yǎng)基：White，生根培養(yǎng)3、培養(yǎng)基的選擇查閱文獻(xiàn)資料，參考已有研究結(jié)果選擇基本培養(yǎng)基確定激素種類和濃度（配方）自己實(shí)驗(yàn)4、培養(yǎng)基的配制（1）、母液配制：母液：實(shí)際是一種貯存液，比實(shí)際使用溶液濃度高。方便，準(zhǔn)確。以KNO3為例：1L培養(yǎng)基需要量為19g，在配制母液時(shí)，增加為10倍量即190g，這樣用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，只要1/10的母液量就可以了。4、培養(yǎng)基的配制（1）、母液配制：一般把母液分成大量元素、微量元素、有機(jī)物等幾類進(jìn)行配制。大量元素配制成10-20×的母液微量元素配制成100-200×的母液有機(jī)一般配制成100×的母液激素單獨(dú)配制成1mg/ml的母液

4、培養(yǎng)基的配制2、培養(yǎng)基的配制稱取適量的糖（固體培養(yǎng)基還需要瓊脂），溶解根據(jù)要配制的培養(yǎng)基體積按比例加入所需體積的母液（如有瓊脂則需煮沸至澄清）加入激素，定容（熱不穩(wěn)定激素需滅菌后加入）調(diào)節(jié)pH值為5.8~6.0（這一步一定要最后操作）二、滅菌滅菌、消毒、防腐物理方法：熱力滅菌干熱160度2h玻璃和金屬器皿濕熱高壓蒸汽滅菌都適用電離輻射：各種射線一次性器械和物品如注射器紫外滅菌：紫外線照射20~30min空氣和物體表面消毒二、滅菌化學(xué)方法：重金屬鹽如0.1%HgCl2氧化劑如高錳酸鉀、10%NaClO表面活性劑：酒精、潔爾滅甲醛等二、滅菌過(guò)濾除菌：適用于不能通過(guò)高溫高壓滅菌的物質(zhì)，應(yīng)用各種細(xì)菌過(guò)濾器滅菌。針頭式濾器、正壓式金屬濾器二、滅菌接種室和培養(yǎng)室：定期熏蒸滅菌熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，一般每100ml甲醛加5g高錳酸鉀三、外植體的選取及接種培養(yǎng)1、外植體（explant）的選取外植體：是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。用于外植體分離的母體植物材料一般有三種來(lái)源：一是生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物；二是有目的地培育在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物；三是無(wú)菌環(huán)境下已經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)的植物。二、外植體的選取及接種培養(yǎng)1、外植體（explant）的選取根據(jù)培養(yǎng)需求選擇植物部位

多年生植物注意樹齡和季節(jié)

在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體2、外植體滅菌1、常用消毒劑及特點(diǎn)消毒劑使用濃度(%)消毒時(shí)間(min.)效果殘液去除難易次氯酸鈣/納105～30好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞0.1～12～10最好最難過(guò)氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mgl-130～60較好較難不同外植體在滅菌劑濃度、時(shí)間、程序上有所區(qū)別2、外植體滅菌消毒劑的篩選設(shè)計(jì)？2、外植體滅菌滅菌程序及篩選外植體清洗整理殺菌劑滅菌無(wú)菌水清洗不同外植體在滅菌劑濃度、時(shí)間、程序上有所區(qū)別準(zhǔn)備室超凈臺(tái)上70%酒精1minNaClO/HgCl2洗4~5次3、接種用解剖刀、鑷子將外植體分割成適當(dāng)大小于酒精燈旁打開培養(yǎng)瓶蓋用滅過(guò)菌的鑷子將外植體接入培養(yǎng)基中蓋培養(yǎng)瓶蓋，注明材料、日期等信息。培養(yǎng)4、培養(yǎng)溫度：24℃左右一般材料20~30℃光照：初期弱光，后期強(qiáng)光；光周期一般12~16小時(shí)氣體調(diào)節(jié)（O2）：四、常見污染及原因污染原因：