甲苯和二甲基亞對斑馬魚胚胎生長和發(fā)育的影響

甲苯和二甲基亞對斑馬魚胚胎生長和發(fā)育的影響

一般溶劑二甲基亞（丙酮醇）、丙酮和乙醇濃度在正常濃度下，對一般環(huán)境毒性動物（如魚類和雙棲動物）沒有顯著的毒性影響。甲苯作為一種常見的有機溶劑,其脂溶性高,揮發(fā)性較強,可通過鰓、體表進入魚體,能輕易透過血腦屏障,進而抑制乙酰膽堿酯酶活性,并造成神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷、影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,具有明顯的神經(jīng)毒性效應在本研究中,選取低劑量的甲苯(0.05%)和不高于0.45%的DMSO,研究助溶劑單一、復合暴露后,對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應;同時,為進一步驗證斑馬魚胚胎毒性實驗結果,選擇人胚腎293細胞株和人胃癌7901細胞株,研究助溶劑對離體細胞活力的影響,以綜合評價其毒性效應.1實驗方法1.1實驗材料將性成熟斑馬魚(1.2染毒斑馬魚胚胎發(fā)育情況觀察挑選正常發(fā)育的受精卵,3hpf開始染毒進行暴露實驗.實驗于直徑為7cm的玻璃表面皿中進行,所用水均取自系統(tǒng)曝氣水.試驗濃度為:0(對照組)、0.05%甲苯、0.45%DMSO、0.1%(DMSO+甲苯)、0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)(在特定時間段(受精后12h,36h,60h,84h,108h,132h,156h等)對染毒斑馬魚胚胎死亡數(shù)、孵化數(shù)進行統(tǒng)計.觀察胚胎的形態(tài)變化,如:發(fā)育停滯、心包水腫、卵黃水腫、脊柱卷曲等畸形狀況.1.3細胞密度和細胞密度的檢測MTT比色法測定細胞活力.人胚腎HEK-293細胞株和人胃癌SGC-7901細胞株分別使用DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng).用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞,加入新鮮培養(yǎng)基輕輕吹打制成細胞懸液,用血細胞記數(shù)板計算細胞密度,用培養(yǎng)基稀釋到1×10采用SPSS10.0分析全部數(shù)據(jù),實驗結果用平均值±標準誤差表示.2結果與討論2.1dmso和甲苯對斑馬魚胚胎孵化的影響甲苯和DMSO復合暴露對斑馬魚胚胎的致死效應如圖1A所示.與對照組相比,隨著暴露時間的延長,0.45%DMSO單一暴露組對斑馬魚胚胎沒有顯著致死效應,0.05%甲苯單一暴露組的胚胎死亡率為12%(156hpf),0.1%(DMSO+甲苯)助溶劑復合物對斑馬魚胚胎的死亡率無明顯效應;但0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)助溶劑復合物可明顯提高斑馬魚胚胎的死亡率,暴露到156hpf時,0.3%(DMSO+甲苯)助溶劑復合物可造成39%的斑馬魚胚胎死亡,而0.5%(DMSO+甲苯)暴露組斑馬魚胚胎死亡率為74%,這表明,隨著助溶劑復合物中DMSO含量的增加,斑馬魚胚胎的死亡率顯著上升.甲苯和DMSO各暴露組對斑馬魚胚胎孵化率的影響如圖1B所示.對照組斑馬魚胚胎48hpf時開始出膜,胚胎發(fā)育到60hpf時,80%的胚胎均已正常孵化出膜,84hpf時,所有對照組胚胎均已孵化出膜,胚胎孵化率為100%.與對照組相比,DMSO單一暴露組、0.1%(DMSO+甲苯)助溶劑復合物暴露組的斑馬魚胚胎總孵化率均無顯著差異,0.05%甲苯暴露組的胚胎孵化率為92%,但各暴露組斑馬魚胚胎在60hpf和84hpf時的孵化率均顯著低于對照組,說明DMSO和甲苯均可阻礙斑馬魚正常胚胎發(fā)育.另外,與對照組以及甲苯、DMSO單一暴露組相比,0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)助溶劑復合物暴露組的胚胎孵化率顯著降低,暴露到108hpf時,0.5%(DMSO+甲苯)暴露組的胚胎孵化率僅為37%.上述結果說明,DMSO和甲苯對斑馬魚胚胎發(fā)育存在明顯的復合毒性效應,隨著助溶劑復合物中DMSO比例的增加,DMSO和甲苯復合物可顯著降低斑馬魚胚胎孵化率并造成大量斑馬魚胚胎死亡.在實驗過程中,我們還發(fā)現(xiàn)甲苯以及甲苯和DMSO復合物可造成斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩并造成大量的畸形.如圖2所示,與對照組(圖2A、C)相比,0.05%甲苯、0.1%(DMSO+甲苯)、0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)實驗組的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)不同程度的發(fā)育停滯(圖2B),并可觀察到心包、卵黃水腫(圖2D、E)、尾巴彎曲(圖2F)等畸形現(xiàn)象.甲苯、DMSO阻礙斑馬魚胚胎發(fā)育并造成斑馬魚胚胎發(fā)育畸形的具體數(shù)據(jù)如表1所列.與DMSO、甲苯復合物對斑馬魚胚胎孵化率、死亡率的結果相同,隨著助溶劑復合物中DMSO比例的增加,DMSO、甲苯復合物可顯著阻滯斑馬魚胚胎的正常發(fā)育,并造成大量的胚胎畸形.甲苯以及甲苯和DMSO復合物對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性結果表明,低劑量的甲苯(0.05%)單一暴露對斑馬魚胚胎具有較小毒性,但甲苯與DMSO混合物對斑馬魚胚胎具有很強的復合毒性效應.甲苯的神經(jīng)毒性效應主要表現(xiàn)為抑制生物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性,并干擾神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育,但其急性毒性較低,大鼠經(jīng)口LD2.2甲苯和dmso復合暴露對體外培養(yǎng)細胞活力的影響甲苯和DMSO對人胚腎HEK-293細胞和人胃癌SGC-7901細胞的活力影響如圖3所示.與斑馬魚胚胎發(fā)育毒性實驗結果不同的是,甲苯和DMSO單一、復合暴露24h和48h后,對人胚腎HEK-293細胞和人胃癌SGC-7901細胞的活力均未造成顯著影響,這說明甲苯以及甲苯、DMSO復合物對體外培養(yǎng)的細胞株沒有明顯的毒性效應.甲苯作為一種脂溶性的毒物,主要作用位點是神經(jīng)系統(tǒng),對神經(jīng)細胞如海馬細胞等具有一定的毒性效應,但對其它種類的細胞株影響較小3助溶劑對dmso和甲苯毒性效應的模擬實驗結果證實DMSO可通過增加甲苯在水中的分散性,顯著提高低濃度甲苯(0.05%)對斑馬魚胚胎的毒性效應,DMSO和甲苯存在明顯的復合毒性效應.利用離體實驗模型評估D