檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法

專利檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法01專利背景技術(shù)領域?qū)嵤┓绞桨l(fā)明內(nèi)容權(quán)利要求榮譽表彰目錄0305020406基本信息《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》是中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局和深圳市匹基生物工程股份有限公司于申2005年2月28日請的發(fā)明專利，該專利的申請?zhí)枮?7，公布號為CN，公布日為2006年9月6日，發(fā)明人是魏傳忠、張鶴曉、賴平安、楊偉、高志強、張利鋒、劉環(huán)、劉繼紅、郭晉優(yōu)、李寧、谷強、汪琳、吳丹、段生濤、張向東?！稒z測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》涉及檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法，尤指一組用以檢測各亞型的禽流感病毒的特異性核苷酸序列、含有這些序列的試劑盒、以及用該組序列與試劑盒檢測禽流感病毒的方法，屬于檢驗檢疫領域。一組用于檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.1－No.3所示的堿基序列。該發(fā)明的有益效果為：快速、敏感、特異、靈敏、操作簡單；試劑盒給檢測者提供了質(zhì)量優(yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，經(jīng)過簡單的培訓，檢測者就可勝任該項工作。2014年11月6日，《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》獲得第十六屆中國專利優(yōu)秀獎。專利背景專利背景禽流感是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病，是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征。截至2005年2月，根據(jù)血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N），可將A型流感病毒分為不同亞型，已報道的有15種血凝素HA亞型（H1～H15）和9種神經(jīng)氨酸酶NA亞型（N1～N9）。禽流感病毒呈世界分布，絕大多數(shù)禽流感病毒呈隱性感染，不表現(xiàn)任何臨床癥狀，只有少數(shù)禽流感病毒具有迅速傳播和高致死性的特性，稱之為高致病力禽流感病毒（HPAI）。高致病力禽流感通常是由H5和H7亞型禽流感病毒引起的，是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類傳染病，中國也將其列為一類檢疫對象。1994年，墨西哥在其中部地區(qū)發(fā)病的商品雞群中分離出H5N2禽流感病毒；1995年，美國猶他州發(fā)生由H7N3引起的禽流感，在方圓800公里的暴發(fā)地區(qū)內(nèi)，比較集中的火雞群相互之間都受到了感染；1997年香港的養(yǎng)雞場和禽類市場爆發(fā)了由H5N1引起的禽流感，并導致人的嚴重疾病，在全世界引起極大恐慌；1999年，意大利發(fā)生了由H7N1引起的禽流感，火雞的死亡率很高；2001年，香港再度受到禽流感病毒H5N1的困擾。自韓國2001年從上海出口的鴨肉中檢測出禽流感病毒H5亞型后，日本、歐盟等對中國出口禽肉采取嚴厲檢疫措施，日本聲稱從中國出口的禽肉中多次檢出高致病力禽流感病毒H9亞型，2003年4月，在中國受“非典”影響出口滑坡的情況下，日本從中國出口鴨肉中三次檢出禽流感病毒H5亞型，導致封關(guān)。在中國國內(nèi)疫情復雜、中國國外頻頻對中國出口禽肉檢出問題的嚴峻形勢下，如果不采取嚴格的檢驗檢疫措施，勢必影響禽肉的出口。禽流感主要依靠實驗室進行確切診斷，診斷方法主包括血清學檢測及病原的分離和鑒定兩方面。血清學檢測的對象是從禽類體內(nèi)采集血液析出血清后，檢測血清中抗體的有無和滴度變化。發(fā)明內(nèi)容專利目的有益效果技術(shù)方案發(fā)明內(nèi)容專利目的《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》的第一個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列。該發(fā)明的第二個目的是提供一組特異性強、靈敏度高的用于檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列。該發(fā)明的第三個目的是提供一種操作簡單、結(jié)果準確的用與檢測禽流感病毒的試劑盒。該發(fā)明的第四個目的是提供一種快捷、準確、方便的檢測禽流感病毒的方法。

技術(shù)方案禽流感病毒通用引物、探針序列：上游引物：CGTCAGGCCCCCTCAAA下游引物：AAGATCTGTGTTCTTTCCTGCAAA探針：FAM-CGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-TAMRA作為探針的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報告基團（FAM）和熒光淬滅基團（TAMRA），委托美國IntegratedDNATechnologies，inc合成。選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設計多對通用引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。進行大量篩選試驗得到以上序列，該通用引物和探針序列不僅能夠用來檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型，而且對其他禽流感病毒亞型也能檢出，用其檢測常見其他禽類病毒，未發(fā)現(xiàn)交叉反應。該通用引物可以在短時間內(nèi)檢測出樣本是否感染了禽流感病毒，節(jié)約人力和物力和檢測時間。有益效果1）快速：從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時左右；2）敏感：檢測組織臟器和拭子的靈敏度與雞胚病毒分離基本一致；3）特異：與常見禽類其他病毒不發(fā)生交叉反應，而且不僅采用了特異性的引物，還采用了特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)PCR方法，杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結(jié)果；4）靈敏：由于采用了特異性的熒光探針和高靈敏度的熒光PCR儀，使該方法比傳統(tǒng)的PCR方法靈敏度高100～1000倍。對于禽流感病毒尿囊液，稀釋至10-7仍可檢出，接近雞胚病毒分離；5）操作簡單：試劑盒給檢測者提供了質(zhì)量優(yōu)異的試劑及優(yōu)化的操作程序，經(jīng)過簡單的培訓，檢測者就可勝任該項工作。

技術(shù)領域技術(shù)領域《檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法》涉及檢測禽流感病毒的核苷酸序列、試劑盒及檢驗方法，尤指一組用以檢測各亞型的禽流感病毒的特異性核苷酸序列、含有這些序列的試劑盒、以及用該組序列與試劑盒檢測禽流感病毒的方法，屬于檢驗檢疫領域。

權(quán)利要求權(quán)利要求1.一組用于檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.1-No.3所示的堿基序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組用于檢測各型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQIDNo.3的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報告基團FAM和熒光淬滅基團TAMRA。3.一組用于檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，具有序列表SEQIDNo.4-SEQIDNo.6所示的堿基序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一組用于檢測H5亞型禽流感病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述序列表SEQIDNo.6的核苷酸序列在5’端和3’端分別連接熒光報告基團FAM和熒光淬滅基團TAMRA。5.一種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特征在于：采用權(quán)利要求1-4所述的核苷酸序列作為檢測禽流感病毒的引物I、引物II或探針序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測禽流感病毒的試劑盒，其特征在于：其組成如下：1）裂解液；2）RT-PCR反應液，終濃度配制成：10×PCR緩沖液；1uTaqE；0.2微摩爾/升引物I；0.2微摩爾/升引物II；0.1微摩爾/升探針；0.實施方式實施方式實施例1.篩選通用引物和探針序列一.材料：涉及的毒種由北京出入境檢驗檢疫局分離保存二.方法（一）設計合成引物和探針序列A型流感病毒的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成，該試劑盒選擇禽流感病毒RNA作為靶區(qū)域。選擇A型禽流感病毒的共有NP基因序列設計多對通用引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，GC含量為50％-60％，引物內(nèi)無二級結(jié)構(gòu)和重復性，引物間和引物內(nèi)無互補序列，引物間的熔解溫度（Tm值）相差小于5℃。探針的長度在25個堿基左右，Tm值比引物Tm值高5℃左右。引物和探針從不同廠家合成，如上海生工、大連寶生物、中國國外公司如GIBCO/BRL、IDT等等，要求PAGE純或HPLC純，到貨時同時提供廠家對該產(chǎn)品的質(zhì)檢證明