細(xì)胞永生化實(shí)驗(yàn)

正常細(xì)胞的壽命是有界限的，體內(nèi)細(xì)胞是這樣，體外培養(yǎng)的細(xì)胞也是如此。

細(xì)胞永生化實(shí)驗(yàn)則是針對體外培養(yǎng)的細(xì)胞而建立的。Hayflick界限Hayflick界限：體外培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定壽命的，其增殖不是無限的，而是有一定界限，這個(gè)界限稱為Hayflick界限。在體外培養(yǎng)的人正常細(xì)胞,經(jīng)一段時(shí)間的分裂,就會進(jìn)入一種生長抑制狀態(tài),即衰老期(M1期)。大多數(shù)真核生物細(xì)胞(生殖細(xì)胞、干細(xì)胞除外)都具有這種特性。經(jīng)轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞可越過衰老期而進(jìn)入另一增殖抑制狀態(tài),即危機(jī)期(M2期),危機(jī)期的細(xì)胞開始出現(xiàn)退化,并逐漸死亡。只有少數(shù)細(xì)胞在一定因素的影響下,端粒酶被激活,以自身RNA為模板合成端粒DNA來補(bǔ)充或延長端粒,恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性,從而使細(xì)胞越過危機(jī)期,發(fā)生了永生化。什么是細(xì)胞永生化？細(xì)胞永生化是指體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機(jī)中逃離,從而具有無限增殖能力的過程。正常細(xì)胞的增殖能力有限,經(jīng)過一定時(shí)間的增殖后,最終會進(jìn)入一種生長抑制狀態(tài),而一些腫瘤細(xì)胞可以無限增殖。細(xì)胞永生化意義了解細(xì)胞增殖與衰老的分子機(jī)制及保存一些重要疑難病例的樣本。為治療腫瘤、控制腫瘤細(xì)胞的增殖以及器官移植的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于永生化細(xì)胞具有可以多次傳代的這一特性,我們可以利用各種細(xì)胞永生化的方法使那些傳代困難、增殖慢、易衰老的細(xì)胞獲得永生,從而提供更多的細(xì)胞資源。秦巴山區(qū)MR家系人群資源庫建立的意義本研究力圖在先期研究積累的秦巴山區(qū)MR家系調(diào)查資料和遺傳資源的基礎(chǔ)上，建立秦巴山區(qū)MR家系資料庫、DNA組織樣品庫、外周血B淋巴細(xì)胞永生細(xì)胞株庫。一方面，可為我們今后進(jìn)一步搜尋和定位MR的相關(guān)基因，開展MR遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究提供長期可靠的遺傳資源。另一方面，由于MR特別是NSMR主要表現(xiàn)為智力低下和認(rèn)知與行為障礙，因此人們認(rèn)為能引起NSMR的基因很可能與人的智力、認(rèn)知能力的分子機(jī)制有關(guān)，與腦發(fā)育和腦功能的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)有關(guān)系。所以本研究在建立MR家系資料庫中所積累的MR家系人群的智力與行為測驗(yàn)資料，也將對進(jìn)一步開展基因與認(rèn)知的相關(guān)性研究，促進(jìn)腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，開拓出認(rèn)知神經(jīng)遺傳學(xué)的新領(lǐng)域有重要的基礎(chǔ)研究意義。EB病毒轉(zhuǎn)化人類外周血B-淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞系

EB病毒(epsteinbarrvirus)轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞(B-LC),使其成為一種能連續(xù)分裂永久生存的類淋巴母細(xì)胞(lymphoblastoid),由此建立的類淋巴母細(xì)胞株即為永生細(xì)胞株

(immorta1izedcelllines),它可永遠(yuǎn)傳代,并且每一種永生細(xì)胞株保存了原來提供血樣個(gè)體的完整基因組,而且它的生化和分子生物學(xué)特性不發(fā)生變化,可作為生物標(biāo)本庫建立的首選方法。利用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B-淋巴細(xì)胞建立精神發(fā)育遲滯永生細(xì)胞庫,或各種疾病,特別是罕見疾病永生細(xì)胞庫已成為當(dāng)今永久保存全基因組的首選方法,

它可為精神發(fā)育遲滯及其它罕見疾病的遺傳流行病學(xué)、臨床遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等研究提供永久性試驗(yàn)材料。EB病毒的特征之一是對B細(xì)胞有天然的親和力并使其發(fā)生轉(zhuǎn)化,EBV引起的是一種無休止的細(xì)胞分裂和DNA的無限的合成。此外,EBV在體外對B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率很高,一般都能達(dá)到80%-100%。因?yàn)樯鲜鎏攸c(diǎn),世界上許多遺傳研究中心都用此方法作為常規(guī)處理每一份血標(biāo)本,建立人類遺傳種質(zhì)庫。病毒轉(zhuǎn)化后的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(B-LCLs)依然保存了B細(xì)胞的分化特征和免疫表型，作為抗原遞呈細(xì)胞，它可以攝取加工抗原，并將其載體部分表達(dá)于細(xì)胞表面，供T細(xì)胞受體識別；也可作為抗體基因的來源，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備分泌相應(yīng)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。EBV簡介Epstein-Barr病毒(EBV)是1964年首先從非洲惡性Burkitt淋巴瘤(BL)的淋巴母細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，屬皰疹病毒科γ亞科。EBV有一個(gè)與其他DNA病毒不同的特點(diǎn)，就是它在體外對B細(xì)胞的感染可刺激細(xì)胞的持續(xù)性生長并引起細(xì)胞的永生化，從而形成淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系(1ymphoblastoidcelllines，LCLs),尤其對人二倍體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果極佳。EBV主要通過結(jié)合人類B淋巴細(xì)胞膜上的EB病毒受體而感染B淋巴細(xì)胞，初次受到感染便被迅速致敏，36h后就可有DNA合成。被感染的B細(xì)胞在EB病毒核抗原的刺激下轉(zhuǎn)化為類淋巴母細(xì)胞，其端粒酶活性提高，維護(hù)了細(xì)胞染色體端粒長度的穩(wěn)定，并能夠不斷分裂增殖，從而促使B淋巴細(xì)胞的永生性生長。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株染色體穩(wěn)定，保留了原有的遺傳性狀。人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化是建立永生細(xì)胞系及進(jìn)行細(xì)胞遺傳和分子遺傳研究的極好方法。實(shí)驗(yàn)材料和方法試劑產(chǎn)生EBV的B95-8細(xì)胞株，RPMI1640培養(yǎng)基，PBS緩沖液，胎牛血清，淋巴細(xì)胞分離液，環(huán)孢霉素A，植物凝集素，臺盼藍(lán)染液標(biāo)本的收集取樣：無菌、輕輕搖動(dòng)使血液與肝素混勻秦巴山區(qū)精神發(fā)育遲滯患者家系（兩天之內(nèi)的血樣）實(shí)驗(yàn)方法

EB病毒的制備EB病毒基因組序列及其表達(dá)研究主要是用B95-8株進(jìn)行的,B95-8細(xì)胞系是用傳染性單核細(xì)胞增多癥患者的EB病毒感染絨猴B淋巴細(xì)胞建立的。在B95-8細(xì)胞系中只有很少一部分細(xì)胞可以自發(fā)產(chǎn)生病毒,其他細(xì)胞呈隱性狀態(tài),用不同的誘生劑如TPA誘生后,使產(chǎn)生病毒的細(xì)胞明顯增加。B95-8在EB病毒轉(zhuǎn)化B-淋巴細(xì)胞過程中非常重要,通過培養(yǎng)B95-8細(xì)胞制備出大量高效價(jià)的EB病毒液,對于B95-8細(xì)胞的培養(yǎng)質(zhì)量是EB病毒轉(zhuǎn)化B-淋巴細(xì)胞成敗的關(guān)鍵。復(fù)蘇B95-8細(xì)胞株，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，1000r/min離心10min,棄上清，加入完全RPMI-1640培養(yǎng)液(含10％FBS，含Pen／Strep)，每2-3d半量加液一次，待細(xì)胞數(shù)達(dá)到lxl06／mL時(shí)，饑餓細(xì)胞4-7d后，收集上清液，-70℃及37℃反復(fù)凍融3次,再轉(zhuǎn)移至離心管中,2000r/min離心15min，將上清液用0.22μm濾膜過濾后分裝至1.5mlEpendof管中,平均1.2ml/管,-80℃保存。淋巴細(xì)胞EBV轉(zhuǎn)化法（1）將血樣靜置30分鐘，期間進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（2）冰箱中取出4℃避光保存的淋巴細(xì)胞分離液。搖勻后在無菌狀態(tài)下取4mL加入刻度離心管中，37℃水浴中平衡。（3）PBS緩沖液將血樣1:1稀釋混勻（各3mL）。（4）將稀釋的血液沿離心管壁徐徐加到分離液液面上。（5）室溫下2000r/m離心20m。2000rpm,30minPBMC紅細(xì)胞、粒細(xì)胞稀釋的血漿、血小板FicollFicoll（6）吸出淋巴細(xì)胞上方2-3mm的透明血漿。將吸管輕輕沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細(xì)胞，以及它下面一半的淋巴細(xì)胞分離液，然后轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)離心管中。（7）洗滌充分混勻后，2000r/m離心10m。沉淀經(jīng)PBS緩沖液吹打清洗。吹打均勻后對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

計(jì)數(shù)方法如下：取5μL洗滌液與5μL1%臺盼藍(lán)染色液在小離心管混合均勻，將其吸出置于計(jì)數(shù)板上于倒置顯微鏡下檢測細(xì)胞活力（應(yīng)大于95%），并計(jì)數(shù)細(xì)胞。通常，每毫升外周血可得1×106~2×106個(gè)

PBMC。在染色期間可對細(xì)胞進(jìn)行第二次洗滌操作，首先吸出離心管內(nèi)的PBS緩沖液，然后再加入新的PBS緩沖液，2000r/m離心10m。管內(nèi)沉淀即為所需細(xì)胞。（8）分離的淋巴細(xì)胞懸于1mL含EBV的上清，密度為2×106/mL，T25組織培養(yǎng)瓶中垂直放置于CO2培養(yǎng)箱3h孵育。（9）培養(yǎng)2000r/m離心10m，5mLRPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，加入終濃度為0.2μg/mL的環(huán)孢霉素A，充分混勻后等量移入T25組織培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待液體稍黃，補(bǔ)加2mL完全培養(yǎng)基。（10）凍存與復(fù)蘇將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行凍存，之后過一段時(shí)間進(jìn)行復(fù)蘇，并檢測細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、LCLs的光鏡下形態(tài)接種后7～15d，培養(yǎng)板內(nèi)可以看見有細(xì)胞體積增大、變形呈梭狀；細(xì)胞變透亮，開始出現(xiàn)細(xì)胞分裂、聚團(tuán)，大約2～3周開始形成細(xì)胞克隆團(tuán)。以后，隨著細(xì)胞分裂增生，細(xì)胞數(shù)量不斷增多，細(xì)胞克隆團(tuán)不斷增大，呈懸浮式生長，高倍鏡下可見細(xì)胞團(tuán)邊緣有毛刺狀突起。1d4d7d20d30d2、染色體核型分析G帶分型染色體顯帶是將染色體標(biāo)本經(jīng)過一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現(xiàn)明暗或深淺相間的橫紋――染色體帶，這種技術(shù)，稱為染色體顯帶技術(shù)。通過顯帶，人們可以準(zhǔn)確地識別每一條染色體及染色體上的各個(gè)區(qū)段，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)變化。在所有的顯帶技術(shù)中，G顯帶（Gbanding）是最常見的顯帶技術(shù)，它是將染色體標(biāo)本用堿、胰蛋白酶或其它鹽溶液處理后，再用Giemsa染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱G帶（Gband）。G顯帶方法簡便，帶紋清晰，染色體標(biāo)本可以長期保存，因此被廣泛用于染色體病的診斷和研究。3、病毒基因檢測EBV基因組含有100多個(gè)開放閱讀框(ORF),在這100多個(gè)基因中只有幾個(gè)在EBV潛伏感染的B淋巴細(xì)胞中表達(dá),稱為潛伏基因。根據(jù)這些基因的細(xì)胞內(nèi)定位,將其表達(dá)產(chǎn)物分為三大類：EBNA蛋白家族(EBV核抗原-1，EBV核抗原-2，EBV核抗原-LP，EBV核抗原-3)、LMP蛋白家族(潛伏膜蛋白1、潛伏膜蛋白-2A、潛伏膜蛋白-2B)以及兩種非多聚腺苷酸化的小RNA(EBER1和EBER2)。突變的試驗(yàn)病毒株和病毒重組體的研究證明，大部分潛伏蛋白的表達(dá)對于B細(xì)胞的有效永生化是必需的。這些潛伏蛋白在EBV介導(dǎo)的細(xì)胞永生過程中起著重要的作用。對EB病毒轉(zhuǎn)化活性的研究表明，EB病毒的潛伏膜蛋白l（LMP1）基因是EB病毒永生化基因中唯一能夠使體外培養(yǎng)的人或嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的致瘤性基因。潛伏膜蛋白1（LMP1）是EBV在潛伏狀態(tài)時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)，在許多EBV相關(guān)的疾病及腫瘤中表達(dá)，是眾多EBV編碼蛋白中被明確證明能惡性轉(zhuǎn)化鼠纖維母細(xì)胞、B細(xì)胞和人上皮細(xì)胞的蛋白，LMP1促轉(zhuǎn)化致瘤作用機(jī)制其實(shí)非常復(fù)雜需進(jìn)一步闡明，尤其是目前對LMP1與宿主蛋白間的相互作用知之甚少。LMP1缺失的EBV重組體不再能轉(zhuǎn)化B細(xì)胞，說明LMP1對于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是必不可少的。具體操作提總RNA反轉(zhuǎn)錄合成c