小學(xué)期9七年制基因組王麗華

實(shí)驗(yàn)安排1、上午：基因組DNA的提取2、中午：酶切3、下午：瓊脂糖凝膠電泳鑒定移液器生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)微量分析1、根據(jù)取樣量，選擇合適量程的加樣器。2、如何調(diào)節(jié)？順時(shí)針調(diào)節(jié)---讀數(shù)變小逆時(shí)針調(diào)節(jié)---讀數(shù)變大注意：調(diào)節(jié)前，加樣器讀數(shù)正處于最大量程或最小量程時(shí)，如果向錯(cuò)誤方向調(diào)節(jié)，馬上會(huì)超出量程，將會(huì)損害加樣器的精度。（1）吸頭的安裝要緊密。（2）打到第一擋，將吸頭插入液面下適當(dāng)深度，緩慢松開(kāi)拇指，吸取液體。拇指完全放開(kāi)后，吸頭在液面下停留一下（約半秒鐘）（3）將外壁液體用容器口引流回容器。吸頭內(nèi)的體積應(yīng)大致正確。（5）貼目的容器內(nèi)壁，加樣器推到第二擋。將液體勻速打到目的容器內(nèi)，觀察吸頭內(nèi)液體是否完全打出。加樣器的使用臺(tái)式高速離心機(jī)centrifugation生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)離心1、打開(kāi)電源。2、蓋緊蓋子,防止離心機(jī)被腐蝕。3、標(biāo)記，配平,對(duì)稱放入離心機(jī)(管的連接處朝外).4、設(shè)定離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間5、統(tǒng)一離心。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

廢液廢頭污染廢物污物處理

實(shí)驗(yàn)步驟第一部分：裂解細(xì)胞膜、提取白細(xì)胞核第二部分:裂解核膜，釋放基因組。第三部分：去蛋白第四部分：乙醇沉淀DNA第五部分：酶切，DNA電泳操作(標(biāo)管號(hào))1抗凝血--0.3ml

。2STMT--1ml，充分顛倒混勻（酒紅色）。310,000×g離心2min，棄上清，倒置于濾紙。4生理鹽水--0.4ml,

混勻,10,000×g離心2min,棄上清。5

NE溶液--450μl

懸浮沉淀。610%SDS--50μl

迅速混勻，蛋白酶K--50μl，輕輕搖勻，水浴1h（50℃）。7

TE飽合酚--500μl，輕搖2min，

10,000×g離心1min，上層水相移至另一Ep管（用100μl槍×？次）全取。8酚－氯仿－異戊醇（25:24:1）500μl，輕搖1min，

10,000×g離心1min，上層水相移至另一Ep管（用100μl槍×？次）全取。9

氯仿－異戊醇（24:1）500μl，輕搖1min，10,000×g離心1min，上層水相移至另一Ep管內(nèi)(用100μl槍×？次)計(jì)量。10

NaAc--v，混勻（離心機(jī)甩下）。11

無(wú)水乙醇

--

2倍v，混勻，－70℃15min。操作步驟1011210,000×g離心5min，棄上清。13

濾紙條吸殘液，室溫干燥10min。操作步驟15DNA液--8μl，EcoRⅠ

--1μl(提供內(nèi)切酶反應(yīng)最適條件)10×TE緩沖液--1μl37℃水浴60min14

加雙蒸水--20μl，溶解沉淀8μl：酶切12μl：電泳對(duì)照真核細(xì)胞DNA的分離提取及酶切電泳實(shí)驗(yàn)十八第一部分DNA的分離提取第二部分電泳檢測(cè)掌握人外周血基因組DNA的提取原則和方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法(Genome)樣品：人外周血白細(xì)胞核中DNA基因組DNA1步抗凝血2步STMT溶液3步離心，棄上清，倒置于濾紙4步生理鹽水混勻,離心,棄上清操作原理-1一、裂解細(xì)胞膜提取細(xì)胞核二、裂解細(xì)胞核膜釋放基因組（準(zhǔn)備保護(hù)DNA）5步

NE溶液NaCl（高濃度Na+）EDTA抑制DNase操作原理-2破壞核膜6步SDS溶液三、DNA與蛋白質(zhì)解離6步蛋白酶K：消化組蛋白（除去殘存的酚及蛋白）離心，取上層水相移至另一Ep管；（用100μl槍×？次）全取計(jì)量。7步

TE飽合重蒸酚8步酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）9步氯仿－異戊醇（24:1）四、DNA的純化

去除蛋白等乙醇+鹽五、DNA的濃縮沉淀法

10步

NaAc--v，混勻（離心機(jī)甩下）10111步

無(wú)水乙醇

--

2倍v，混勻，－70℃15min。（低溫利于沉淀）12步離心，棄上清13步濾紙條吸殘液，室溫干燥降低DNA的溶解度，穩(wěn)定DNA分子核酸分離提取的總原則完整性的保證1簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程2減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解（pH4～10）（減少破壞因素）3減少物理因素對(duì)核酸的降解4防止核酸的生物降解機(jī)械剪切力：高速震蕩；快速狹長(zhǎng)孔道；反復(fù)凍溶…高溫：常規(guī)操作溫度為0～４℃核酸分離提取的總原則純度的保證

1其它生物大分子的污染應(yīng)降到最低程度2排除其它核酸分子的污染3不應(yīng)存在對(duì)核酸有影響的有機(jī)溶劑和金屬離子（蛋白質(zhì)，多糖和脂類等）（如提DNA時(shí)，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然）

第二部分基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)準(zhǔn)備工作一、鋪膠1.封口2.溶膠3.加入溴乙啶4.插入樣品梳5.灌膠緩慢連續(xù)，不要形成氣泡151％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：（1）電泳裝置及膠板（一套）

（2）樣品操作步驟①載樣液--2μl+酶解液10μl，混勻（統(tǒng)一加入，離心機(jī)甩下）②

取樣--10μl

（各組分別取樣，依次加樣，墻側(cè)為1組）甘油：樣品下沉溴酚藍(lán)：示蹤指示劑（3）電泳檢測(cè)：100V30-40分鐘DNA液12μl載樣液3μl線性DNA片段（kb）瓊脂糖濃度（%）

5–600.40.8–100.7

0.4–6

1.00.2–41.50.2–31.750.1–32.0

第二部分基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)原理用熒光嵌入染料溴化乙啶染色,紫外光下檢出。

不同濃度瓊脂糖凝膠可分離不同長(zhǎng)度的DNA片段。(agarosegelelectrophoresis)線狀雙鏈DNA分子遷移率與堿基對(duì)數(shù)目對(duì)數(shù)值成反比（1）瓊脂糖濃度：（2）DNA的分子大小：（3）DNA的