抗真菌藥物敏感試驗

抗真菌藥物敏感試驗沈永年概述真菌感染的發(fā)病率,尤其是深部真菌感染的發(fā)病率逐漸增高大量新型抗真菌藥物不斷涌現(xiàn)臨床耐藥菌株的消滅抗真菌藥物敏感實驗為臨床耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)，抗真菌藥物的選擇供應指導。概述抗真菌藥物敏感實驗方法是建立在抗細菌藥物敏感實驗方法基礎之上由于真菌是一種高等的生物，其繁殖方式、生長周期、生長條件等均與細菌不同，因此抗真菌藥物敏感試驗始終是國內(nèi)外學者討論的難題。因此，實驗方法多樣化，但尚無通用的標準方法。美國國家臨床試驗標準委員會（NCCLS）從1992年起，制訂了一系列針對抗真菌藥物敏感實驗的指導性文件，但目前仍不能適用于全部醫(yī)學真菌的檢測。抗真菌藥敏試驗目的指導抗真菌藥物的選擇測定抗真菌藥物對致病真菌的敏感性，供應臨床用藥量及預后監(jiān)測的參考篩選耐藥菌株及研制對致病真菌有效的抗真菌藥物供應臨床應用常見術語最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）

MIC50，MIC90，MIC50％～80％最低殺菌濃度（minimalfungicidalconcentrationMFC）

MFC50，MFC90最低有效濃度（minimaleffectiveconcentration，MEC）抗真菌藥敏試驗方法藥基法瓊脂稀釋法試管（液體）稀釋法微量液體稀釋法菌基法（瓊脂集中法）

ROSCO抗真菌藥敏紙片法E試驗法（E－test）

酵母樣真菌藥物敏感試驗酵母菌液基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗于1992年由美國國家臨床試驗標準化委員會（NCCLS）提出標準實驗方案（M27－P）以來，幾經(jīng)修訂，目前已由M27－A2取代。此外，其他藥物敏感試驗方法如瓊脂稀釋法，瓊脂集中法，E試驗法等時有應用。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)藥液的制備

儲存液：濃度至少為1280μg/mL或10倍于受試的最高濃度。儲存液濃度需依據(jù)藥物本身溶解性決定。氟康唑和5－氟胞嘧啶（5－FC）以滅菌蒸餾水溶解；酮康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、伏力康唑等采納DMSO溶解。儲存液分裝后置－60℃保存。解凍后的儲存液應在24h內(nèi)使用，不得重復凍存使用。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)藥液的制備

使用液：水溶性藥物以無菌蒸餾水將儲存液倍比稀釋至工作液濃度（10倍測試濃度）。非水溶性藥物則需將儲存液用DMSO倍比稀釋至100倍測試濃度，再采納無菌蒸餾水稀釋至工作液濃度（10倍測試濃度），以防止藥物的析出。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)培育基的制備

2倍濃度RPMI1640培育基（不含NaHCO3）作為標準培育基，用0.33mol/LMOPS緩沖液溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.9~7.1（室溫），過濾除菌，4℃可保存4周。在培育基中加入4%葡萄糖可促進菌生長，幫助終點的推斷。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)菌液的制備受試菌在SDA或PDA中35℃培育24小時（念珠菌屬）或48小時（新生隱球菌）。取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個麥氏單位濁度，相當于1×106～5×106/mL，作為菌液的貯備液。使用時，采納2倍量培育基將菌液調(diào)整至工作濃度為1.0×103～5.0×103/mL。再用無菌蒸餾水倍比稀釋成0.5×103～2.5×103/mL。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)實驗步驟：取無菌的15mm×100mm試管進行實驗在試管中依次加入0.1mL倍比稀釋的不同濃度藥物工作液。依次在試管中加入0.9mL菌工作液，混勻。注意整個過程需在15min內(nèi)完成。實驗過程中，設置空白對比和生長對比。同時進行質(zhì)控菌株平行試驗，進行質(zhì)量掌握。將試管置于35℃培育46～50h觀察結(jié)果。對于新生隱球菌，培育時間應延長至70～74h。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)結(jié)果判讀兩性霉素B終點的推斷比較容易，無肉眼可見生長的最低藥物濃度為兩性霉素B的MIC值。氟胞嘧啶及唑類往往在最低濃度時也可消滅輕度渾濁。此時，可取生長對比管中菌懸液0.2mL，加入培育基0.8mL混勻作為推斷終點的濁度（即80％菌的生長受到抑制時的濁度)，與此濁度相近的試管即可判定為終點，其藥物濃度為該藥的MIC值。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)結(jié)果的判定新三唑類藥物酵母菌的MIC值為0.03~16μg/mL，大多數(shù)酵母菌的MIC值小于1μg/mL。目前尚無資料說明MIC值與臨床療效之間的關系。氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑判定標準如下表所示。氟康唑的判定標準不適用于克柔念珠菌。采納不適當?shù)娜苊饺芙庖燎颠蚩蓪е陆Y(jié)果偏差。念珠菌體外藥物敏感試驗的結(jié)果判定標準

敏感（S）劑量依靠敏感（S－DD）中度敏感（I）耐藥（R）氟康唑≤816~32≥64伊曲康唑≤0.1250.25~0.5≥1氟胞嘧啶≤48~16≥32注：如果測定的MIC值位于上述分類之間，則將該菌劃分入高一級類別中試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)注意事項測試藥物的濃度范圍應包括終點濃度和質(zhì)控株的MIC范圍。一般常見藥物的測試濃度范圍：兩性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL；酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL；氟康唑0.125~64μg/mL，新三唑類藥物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)注意事項測試過程中，需進行生長空白對比、空白對比、質(zhì)控菌株對比。應選擇對抗真菌藥物無拮抗作用的緩沖液溶解RPMI1640培育基，如MOPS。Tris緩沖液、PBS緩沖液因可與藥物存在相互作用而不適用。培育基pH值可能影響測試結(jié)果，應嚴格掌握pH值于6.9~7.1。微量液體稀釋法藥液（儲備液和工作液）的制備儲備液的制備同試管稀釋法。與試管稀釋法不同，微量稀釋法的工作液濃度是測試濃度的兩倍。培育基的制備：同試管稀釋法菌液（儲備液和工作液）的制備菌儲備液的制備同試管稀釋法，但工作液濃度稀釋調(diào)整至兩倍測試濃度（即1×103～5×103/mL）即可，不需再用無菌蒸餾水倍比稀釋。微量液體稀釋法試驗步驟

1.藥敏板的制備：采納96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同濃度待測藥物工作液100μl，第1孔為最高濃度，第10孔為最低濃度。制備好的藥敏板可用塑料薄膜包裹后置－70℃保存6月以上。2.取制備好的藥敏板，在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl無菌蒸餾水和100μl菌工作液，作為生長對比；12孔僅加入無菌不含藥物培育基作陰性對比。3.將培育板置于35℃孵育48小時(新生隱球菌為72小時）后讀取結(jié)果。微量液體稀釋法

結(jié)果判讀觀察前，可輕輕震搖藥敏板，使終點判讀更容易。如果消滅菌膜沉淀，須進行吹打、渦旋或其他方法混勻后，在進行結(jié)果判讀。結(jié)果判讀以生長對比孔作為標準，將生長情況進行評分：0：完全透明清亮；1：輕度渾濁2：濁度較生長對比明顯下降；3：濁度較生長對比輕度下降；4：濁度與生長對比全都。微量液體稀釋法結(jié)果判讀兩性霉素B：以評分為0的最低藥物濃度為MIC值5－FC和唑類：評分為2的最低藥物濃度作為MIC值。通過分光光度計檢測顯示，此時大約50％菌生長受到抑制。結(jié)果判讀可縮短至24小時，只要第11孔有菌生長即可進行，對結(jié)果無明顯影響。瓊脂稀釋法

將瓊脂平板中摻入不同濃度的抗真菌藥物，以多點接種法將待測真菌接種于瓊脂表面（各點所種真菌量相同），以菌不生長的最低藥物濃度定為該藥對真菌的MIC。優(yōu)點：可同時測定多個菌株，易于確定終點。比液體稀釋法重復性好。缺點：方法繁瑣，耗時長。瓊脂稀釋法藥液的制備：同試管液基稀釋法，工作液濃度為10倍濃度的測試濃度，各種常用藥物的濃度測試范圍為：兩性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL

酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL

氟康唑0.125~64μg/mL

；

新三唑類藥物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。

瓊脂稀釋法培育基制備RPMI1640培育基:

2倍量:RPMI164020.8g,葡萄糖40g,以0.33M

MOPS緩沖液溶解,調(diào)整pH值至6.9~7.1,過濾除菌,置-20℃保存。HR培育基：

2倍量：29.3gHR培育基，NaHCO3

2.0g，溶于1000mL雙蒸水中，調(diào)整pH值至7.5，過濾除菌，低溫保存。4％瓊脂：

40g瓊脂，溶于1000mL蒸餾水中，高壓滅菌15min，備用。瓊脂稀釋法菌液的制備受試菌在SDA中35℃培育24小時（念珠菌屬）或48小時（新生隱球菌）取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個麥氏單位濁度，相當于1×106～5×106/mL，作為菌液的工作液。

瓊脂稀釋法藥物平板的制備將RPMI1640培育基或HR培育基置60℃預溫。取4％瓊脂，加熱融化后，置60℃，保溫。將培育基和瓊脂1:1混勻，分裝入試管中，每管分裝13.5mL，仍置60℃保溫。將不同濃度藥液（工作液）1.5mL加入試管中，輕輕震搖混勻，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混勻時避開消滅氣泡。37℃，15分鐘，使干燥。如采納平板多點接種，可將培育基18mL，加入不同濃度藥液2mL，混勻倒入9cm直徑平皿，制成藥物平板備用。瓊脂稀釋法接種和培育在藥物平板中接種測試菌液，每點接種1～5μl，可進行多點接種。并設置生長對比平皿，空白對比平皿和標準菌株對比。37℃培育48h或72h（新生隱球菌）終點判定：確定生長對比菌生長良好，空白對比無污染菌生長。逐一觀察從高濃度至低濃度平皿上的生長情況，以菌不生長平皿的藥物濃度作為對該菌的MIC值。瓊脂集中法

將待檢菌摻入瓊脂培育基內(nèi)，將浸有固定濃度的抗真菌藥液紙片置于瓊脂培育基表面，經(jīng)孵育后，依據(jù)紙片周圍真菌生長被抑制的范圍大小確定藥物對真菌的抑制作用。如同時應用系列濃度紙片，尚可測出MIC值。優(yōu)點：簡潔、易行、不需簡潔設備缺點：單一濃度紙片僅能定性，不能確定MIC值。藥物紙片的標準化問題。瓊脂集中法培育基制備基本培育基為MH瓊脂，其中加入2%葡萄糖和亞甲基蘭（0.5μg/mL）。調(diào)整pH值至7.2～7.4（室溫下）。高壓滅菌后分裝入平皿，室溫下冷卻凝固后，37℃溫箱中干燥10～30min，以去除平皿表面水蒸氣。培育基平皿可在2～8℃冰箱保存一周。如采納塑料袋包裹可適當延長。使用前，應抽取同一批次平皿置于30～35℃孵箱中24小時，以確定無污染。瓊脂集中法藥液紙片制備：商品化藥液紙片：應保存于－14℃以下冰箱中。使用前，應提前取出置于室溫中平衡1～2小時。

瓊脂集中法菌液制備同試管稀釋法，受試菌在SDA或PDA中35

℃培育24小時（念珠菌屬）。取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個濁度單位，相當于1×106～5×106/mL，作為菌液的貯備液。瓊脂集中法操作步驟：用棉簽蘸取菌液涂于平板上，重復三次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60o再進行涂布，最后涂布平板邊緣。將浸有藥液的紙片貼于瓊脂表面，可略微加壓保證紙片與瓊脂貼合緊密。紙片與紙片中心距離一般大于24mm。通常，150mm平板紙片數(shù)量不超過12個；100mm平板不超過5個。由于藥物集中在接觸時即已進行，因此，當紙片接觸平板后即不行再移動。將貼有紙片的平皿翻轉(zhuǎn)后置35℃培育20～24小時，觀察結(jié)果。如24小時菌生長不良，可將培育時間延長至48小時。瓊脂集中法結(jié)果判讀藥物對受試菌有生長抑制時，可圍繞紙片形成抑制環(huán)。以明顯受抑制的環(huán)邊緣作為邊界，測量抑制環(huán)大小。環(huán)邊緣針尖大小菌落或環(huán)內(nèi)的大菌落可忽視不計。瓊脂集中法結(jié)果判定

質(zhì)控菌株的參考值（mm）白念珠菌（ATCC90028）近平滑念珠菌（ATCC22019）熱帶念珠菌（ATCC750)克柔念珠菌（ATCC6258）氟康唑（25μg）28～3922～3326～37伏力康唑（1μg）31～4228～3716～25瓊脂集中法結(jié)果判定：耐藥劑量依靠敏感敏感抑菌環(huán)直徑(mm)≤1415～18≥19MIC值(μg/mL)≥6416-32≤8念珠菌氟康唑瓊脂集中法（25μg紙片）結(jié)果與MIC值對比抗真菌藥敏紙片法

丹麥ROSCO公司從20世紀70年月開頭研制抗真菌藥敏紙片，操作簡潔，結(jié)果直觀，易于普及，只要嚴格依據(jù)ROSCO公司Neo－Sensitab抗真菌藥敏紙片方法操作，可與NCCLS－M27p有很好的符合率。主要適用于酵母樣真菌的藥敏試驗。該方法也是一種瓊脂集中法?？拐婢幟艏埰ㄅ嘤杉{SHADOMY瓊脂，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.0，同時添加氯霉素掌握細菌污染。培育基高壓滅菌后，倒入9cm培育皿中制成平板備用。ROSCO抗真菌藥敏紙片分類合名稱類別名稱縮寫劑量（μg）多烯類兩性霉素BAMPHO10制霉菌素NYST50唑類酮康唑KETO15咪康唑MICO10克霉唑CLOTRI10益康唑ECON10氟康唑FLZ15伊曲康唑ITRA8伏力康唑VCR1異康唑ISO10噻康唑TIO10其他氟胞嘧啶FLU1010FLU11灰黃霉素GRIS25環(huán)吡酮胺CIC50特比萘芬TRB30抗真菌藥敏紙片法菌液制備及操作步驟取沙堡瓊脂上30℃培育48小時的待測酵母樣菌半白金耳，磨種至生理鹽水中，充分震蕩后調(diào)整接種液菌濃度至5×105/mL，相當于0.5麥氏濁度單位。將菌液按前述方法用棉拭子涂布于培育基平板上，35℃培育18~24小時，觀察結(jié)果。隱球酵母屬真菌，30℃，42～48小時判讀結(jié)果。基本判讀標準（局部治療用）抗真菌藥名稱敏感中介耐藥環(huán)吡酮胺≥20mm12~19mm≤11mm克霉唑≥20mm12~19mm≤11mm益康唑≥20mm12~19mm≤11mm氟康唑≥20mm12~19mm≤11mm異康唑≥20mm12~19mm≤11mm酮康唑≥20mm12~19mm≤11mm咪康唑≥20mm12~19mm≤11mm噻康唑≥20mm12~19mm≤11mm特比萘芬≥20mm12~19mm≤11mm游霉素≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)制霉菌素≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)伊曲康唑≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)灰黃霉素≥10mm無抑菌環(huán)嚴重系統(tǒng)性感染株判讀標準藥物名稱抑菌圈直徑（mm）Breakpoints，MIC（μg/mL）敏感中介耐藥敏感耐藥兩性霉素B/10μg≥1514～10<10≤1≥4氟康唑/25μg≥2221～15≤14≤8≥64氟胞嘧啶/1μg≥2012～19≤11≤4≥32氟胞嘧啶/10μg≥3023～29≤22≤4≥32伊曲康唑/8μg≥1610～15≤9≤0.12≥1酮康唑/1μg≥3023～29≤22≤0.12≥0.5伏力康唑/1μg≥14≤1酵母紙片藥敏的質(zhì)控

（0.5麥氏濁度，1：1稀釋，培育18～24h）藥物名稱直徑（mm）白念珠菌（ATGG84548）白念珠菌（ATGG64550）光滑念珠菌2338NL（24h）兩性霉素B18～28（s）19～24（s）9～13（s）氟康唑36～42（s）11～17（s）氟胞嘧啶34～40（s）26～33（s）45～53（s）伊曲康唑25～31（s）9（R）酮康唑36～44（s）21～29（I）E試驗法瓊脂集中法的改良，將原單一藥物濃度紙片用含有梯度濃度排列的藥液條代替，通過形成的橢圓形抑菌圈，可推斷藥物的MIC值。本法與瓊脂稀釋法比較，二者的符合率為95％，在提高試驗的敏感度及削減實驗步驟等方面有較大的優(yōu)越性。E試驗法培育基：RPMI1640或HR培育基，含2％瓊脂和2％葡萄糖，制備過程同瓊脂集中法，調(diào)節(jié)pH值至7.0,倒入平皿，冷卻凝固，制成培育基平板。菌液：制備同瓊脂集中法，調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥氏濁度單位。E試驗紙片：有商品供應。紙片上含有梯度濃度排列的藥物。E試驗法操作步驟

1.用棉拭子蘸取菌液涂布于培育基平板

2.將含不同藥物的E試驗藥液塑料條貼于培育基上，150mm

平皿最多貼4～5個；90mm平皿最多貼1～2個。

3.

35℃培育24小時（念珠菌）或48小時（隱球菌屬）后判讀結(jié)果。

E試驗法結(jié)果判讀可見到呈橢圓形的抑菌圈，圈邊緣所指示的相應位置的數(shù)值（藥物濃度）即為MIC值。絲狀真菌（雙相真菌）

藥物敏感試驗由于絲狀真菌生長較慢，體積較大，給絲狀真菌的藥物敏感試驗帶來很多困難。目前，絲狀真菌的藥物敏感試驗無論是在培育基的選擇、菌量的確定或終點推斷上均無標準化的方法。因此，至今尚無重復性好、簡潔易行、被廣泛接受的標準化試驗。一般常用的方法包括瓊脂稀釋法，液體微量稀釋法等。瓊脂稀釋法培育基制備沙氏瓊脂：葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂20g，溶于1000mL蒸餾水，調(diào)整pH至6.8，高壓滅菌。

CAS培育基：Casitone9g，酵母浸膏5g，枸櫞酸三鈉10g，磷酸氫二鈉1g，磷酸二氫鈉1g，葡萄糖10g，瓊脂20g，溶于1000mL蒸餾水，高壓滅菌。

瓊脂稀釋法菌液制備

1.將待測菌株接種于PDA上，28℃培育7～10天

2.取約5mg菌量，置于生理鹽水中，Potter研磨器研碎，經(jīng)四層無菌紗布過濾，以血細胞計數(shù)板計數(shù)分生孢子或碎菌絲成分，以滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)分生孢子或菌絲成分至103/mL。瓊脂稀釋法藥物工作液的制備

參考酵母樣菌試管液基稀釋法的藥液配制。藥物工作液濃度是測試濃度的10倍。瓊脂稀釋法藥物培育基制備

1.

以不同濃度的藥物2mL加至18mL經(jīng)56℃融化的瓊脂中使之混勻，每個濃度藥立即分別倒入直徑9cm的培育皿中，待瓊脂固化后，4℃冰箱中保存。也可采納試管法，即不同濃度藥物0.3mL，加入2.7mL培育基，倒入無菌試管制成斜面?zhèn)溆谩?/p>

2.培育基中的藥物最終濃度為：兩性霉素B

0.03~64μg/mL唑類藥物0.125~128μg/mL特比萘芬0.03~128μg/mL阿莫羅芬0.01~100μg/mL瓊脂稀釋法操作步驟

1.取不同菌液以多點接種法接種入培育基，每點為1～5μl菌液。

2.

28℃，培育3～7天。

3.培育期間，每24小時讀結(jié)果1次，以肉眼判定無菌生長的最低藥物培育皿的濃度為MIC。微量液體稀釋法培育基制備同酵母樣菌試管液基稀釋法，采納含0.33MMOPS的RPMI1640培育基，pH6.9~7.1藥液制備：同酵母樣菌試管液基稀釋法，儲存液濃度至少為1280μg/mL。工作液濃度為2倍測試濃度。微量液體稀釋法菌液制備

1.受試菌株在PDA上35℃培育7天，促進小分生孢子生成（鐮刀菌屬先在35℃培育48～72小時，然后25～28℃培育至7天）。

2.

1mL無菌生理鹽水沖洗菌落，曲霉菌落可在無菌生理鹽水中加入1滴吐溫20。

3.收集沖洗液，靜置3～5分鐘，取上部較均勻混懸液，渦旋混勻，分光光度計測定OD值。曲霉和申克孢子絲菌調(diào)整OD值至0.09~0.11;根霉、鐮刀菌及波氏假阿什利菌調(diào)整至0.15~0.17。

4.將上述懸液用培育基進行1:50稀釋，即得到工作液（2倍最終濃度），約為0.4×104～5×104cfu/mL。微量液體稀釋法試驗步驟

1.采納96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同濃度待測藥物工作液100μl，第1孔為最高濃度，第10孔為最低濃度。

2.在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl無菌不含藥物的培育基和100μl菌工作液，作為生長對比；12孔僅加入無菌不含藥物培育基作陰性對比。

3.培育板置于35℃孵育。根霉在培育21～26小時后，鐮刀菌、曲霉和孢子絲菌在46~50小時，波氏假阿什利菌70～74小時后讀取結(jié)果。微量液體稀釋法結(jié)果判讀結(jié)果判讀以生長對比孔作為標準，將生長情況進行評分。

0：完全透明清亮或無生長；

1：少量生長，大致相當于生長對比孔的25％

2：生長明顯削減，相當于生長對比孔50％

3：生長輕度削減，相當于生長對比孔75％

4：無明顯生長抑制，與生長對比全都微量液體稀釋法結(jié)果判讀

1.兩性霉素B終點易推斷，