發(fā)育與生殖重要哺乳動(dòng)物模型的建立

項(xiàng)目名稱(chēng)：發(fā)育與生殖重要哺乳動(dòng)物模型的建立首席科學(xué)家：賴(lài)良學(xué)中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部門(mén)：中國(guó)科學(xué)院二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：通過(guò)進(jìn)化基因組學(xué)、比較基因組學(xué)等方法，規(guī)?；瘎?chuàng)造和挖掘豬的基因資源；了解小型豬發(fā)育、生理、生殖的基本規(guī)律，闡明小型豬早期胚胎基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理；完善小型豬遺傳修飾的相關(guān)技術(shù)平臺(tái)，推動(dòng)小型豬模型的研究，獲得一批在生殖和發(fā)育研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值的小型豬模型；取得擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新發(fā)現(xiàn)、新技術(shù)和新方法，建立小型豬模型研究的國(guó)際一流基地；造就一支具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的，由優(yōu)秀中青年科學(xué)家組成的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，培養(yǎng)一批能獨(dú)立從事高水平科學(xué)研究的后備力量，加快醫(yī)用小型豬在生物醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用，為發(fā)育和生殖研究提供理想的動(dòng)物模型，最終確立我國(guó)在這一極富競(jìng)爭(zhēng)性的前沿探索領(lǐng)域的領(lǐng)先地位。五年預(yù)期目標(biāo)：建立豬的基因組學(xué)研究技術(shù)方案，利用豬的基因組學(xué)等分子生物學(xué)手段充分挖掘豬的基因資源，獲得較為完善的小型豬基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)；建立完善的小型豬發(fā)育、生理、生殖等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)；新發(fā)現(xiàn)3-5個(gè)在早期胚胎發(fā)育中表現(xiàn)有顯著差異的關(guān)鍵基因，闡明新發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因在早期胚胎分化過(guò)程中對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用；篩選并驗(yàn)證3-5個(gè)在小型豬早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的miRNA，并闡明其調(diào)控機(jī)制。解析早期胚胎分化關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)與基因組修飾技術(shù)建立5-8種生殖發(fā)育相關(guān)豬模型；培養(yǎng)研究生40名，造就一支具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的，由優(yōu)秀中青年科學(xué)家組成的創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，培養(yǎng)一批能獨(dú)立從事高水平科學(xué)研究的后備力量；在本領(lǐng)域的國(guó)際代表性學(xué)術(shù)SCI刊物上發(fā)表40余篇學(xué)術(shù)論文，其中影響因子高于5的不少于12篇。培養(yǎng)一批從事豬模型研究的交叉學(xué)科人才。10．主辦一次小型豬模型研究的國(guó)際性學(xué)術(shù)研討會(huì)。三、研究方案課題設(shè)置的思路及課題間的關(guān)系：本項(xiàng)目以中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院為主體，聯(lián)合深圳華大基因研究院、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、昆明醫(yī)學(xué)院、吉林大學(xué)和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位，圍繞總體研究目標(biāo)，本項(xiàng)目設(shè)立4個(gè)課題組，研究過(guò)程中相互配合、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提倡資源共享。本項(xiàng)目的執(zhí)行采用首席科學(xué)家負(fù)責(zé)制。首席科學(xué)家將充分發(fā)揮課題負(fù)責(zé)人和學(xué)術(shù)帶頭人的作用，采用學(xué)科交叉、分工合作的方式來(lái)實(shí)施研究計(jì)劃。同時(shí)，首席科學(xué)家將在相關(guān)部門(mén)的領(lǐng)導(dǎo)下，根據(jù)國(guó)家規(guī)定，通過(guò)項(xiàng)目專(zhuān)家委員會(huì)，采用激勵(lì)和滾動(dòng)機(jī)制對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行管理。本項(xiàng)目課題設(shè)置上緊密?chē)@生殖發(fā)育研究用小型豬模型建立這一重大科學(xué)問(wèn)題，在研究小型豬基因組學(xué)、發(fā)育生殖基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究的基礎(chǔ)上最終通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得一系列在生殖和發(fā)育研究中具有應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因豬模型。圍繞這一主線，本項(xiàng)目在已有相關(guān)研究工作的基礎(chǔ)上，設(shè)置各有特點(diǎn)，互相緊密聯(lián)系，且互相促進(jìn)的四個(gè)課題，即1).小型豬基因組學(xué)研究；2).小型豬生殖發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)建立及早期胚胎基因表達(dá)調(diào)控研究；3).生殖相關(guān)小型豬模型的建立；4).發(fā)育相關(guān)小型豬模型的建立。其中課題一和課題二的研究為小型豬作為動(dòng)物模型提供最為基礎(chǔ)的、必不可少的基因組數(shù)據(jù)和基因表達(dá)調(diào)控?cái)?shù)據(jù)，為建立模型提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支持；后兩個(gè)課題分別以生殖和發(fā)育模型的建立為主要目標(biāo)分工進(jìn)行，但在模型制作的技術(shù)上又相互緊密聯(lián)系、互相促進(jìn)。本項(xiàng)目課題設(shè)置上保證了各個(gè)課題有機(jī)地結(jié)合，各方面的研究工作既具有明確的研究目標(biāo)，同時(shí)又相互緊密聯(lián)系，形成我國(guó)在這一前沿領(lǐng)域的研究特色。本項(xiàng)目期望在生殖發(fā)育重要哺乳動(dòng)物模型建立的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題上取得重大突破性成果，保證按期完成項(xiàng)目的總體目標(biāo)和五年目標(biāo)課題間關(guān)系概述如下圖。課題間關(guān)系：小型豬模型生殖發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的建課題三：生殖相關(guān)小型豬模型的建

立小型豬模型生殖發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的建課題三：生殖相關(guān)小型豬模型的建

立課題四：發(fā)育相關(guān)小型豬模型的建

立課題一：小型豬基因組學(xué)研究課題二課題一：小型豬基因組學(xué)研究小型豬早小型豬早期胚胎發(fā)期胚胎發(fā)育基因表育基因表達(dá)譜研究達(dá)調(diào)控研提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)建立動(dòng)物模型1r1r1r1『1T理卩1『條件性缺失抑Oct4-生殖細(xì)成熟運(yùn)動(dòng)ISL1+WT1-E去除生制素aGFP胞組織BDNF神經(jīng)心臟GFP腎殖細(xì)胞亞基的轉(zhuǎn)基特異性及其前元發(fā)刖體臟、生小型豬高繁殖因克表達(dá)體轉(zhuǎn)基育研細(xì)胞殖腺發(fā)模型的力小型隆豬CRE豬因小型究小發(fā)育育小型建立豬模型模型模型的豬模型型豬小型豬模型的建立的制備制備的建立模型建立豬型.\立模建建立課題設(shè)置及每個(gè)課題的主要研究?jī)?nèi)容、技術(shù)路線：課題一：小型豬基因組學(xué)研究承擔(dān)單位：深圳華大基研究院；課題負(fù)責(zé)人：李松崗；課題經(jīng)費(fèi)比例：16%主要參加人員：李松崗、杜玉濤、張承擔(dān)單位：深圳華大基研究院；課題負(fù)責(zé)人：李松崗；課題經(jīng)費(fèi)比例：16%主要參加人員：李松崗、杜玉濤、張本課題擬選擇我國(guó)特有的兩種高度近交醫(yī)用小型豬資源：版納小型豬和五指山小型豬作為動(dòng)物模型，利用基因組學(xué)等分子生物學(xué)手段充分挖掘醫(yī)用小型豬的基因資源。利用高通量、快速測(cè)序技術(shù)和系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析方法完成小型豬全基因組測(cè)序工作，構(gòu)建小型豬基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。為小型豬作為動(dòng)物模型提供最為基礎(chǔ)的、必不可少的基因組數(shù)據(jù)，為建立模型提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支持。以人類(lèi)和家豬的基因組為參照，運(yùn)用比較基因組學(xué)方法對(duì)小型豬進(jìn)行全基因組解讀，進(jìn)行跨物種基因注釋?zhuān)页雠c人類(lèi)疾病相關(guān)基因在小型豬里的直系同源基因，為建立小型豬疾病模型建立提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。技術(shù)路線：全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序?qū)π⌒拓i基因組進(jìn)行功能注釋及雜合區(qū)域檢測(cè)V收集整理注釋小型豬生殖與發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)Ir建立完整的小型豬生殖發(fā)育基因數(shù)據(jù)庫(kù)課題二：小型豬生殖發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)建立及早期胚胎基因表達(dá)調(diào)控研究承擔(dān)單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；參加單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)；課題負(fù)責(zé)人：張守全；課題經(jīng)費(fèi)比例：23%；主要參加人員：張永亮、吳珍芳、魏紅江建立兩種小型豬以及課題3，4建立的小型豬模型的生殖生理及發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，為小型豬動(dòng)物模型研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支持；建立小型豬早期胚胎發(fā)育分化的基因表達(dá)譜；確定新發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因在早期胚胎分化過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)譜，并闡明其對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用；闡明5種以上關(guān)鍵基因及MiRNA對(duì)小型豬早期胚胎發(fā)育分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。檢測(cè)兩種小型豬以及課題3，4建立的各種小型豬模型的生殖生理及發(fā)育相關(guān)數(shù)據(jù)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。包括：小型豬基礎(chǔ)生物學(xué)指標(biāo)研究及數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：生殖生理、生化數(shù)據(jù)采集及其數(shù)據(jù)庫(kù)的建立；正常組織學(xué)背景數(shù)據(jù)庫(kù)建立。.小型豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控相關(guān)候選基因的確定與相應(yīng)抗體和探針的獲得根據(jù)小鼠以及人的早期胚胎分化調(diào)控基因研究文獻(xiàn)選定20個(gè)左右候選基因作為本次研究對(duì)象。篩選的原則為：對(duì)早期胚胎分化具有重要的調(diào)控作用；在小鼠和人早期胚胎發(fā)育中的研究較為系統(tǒng)；豬基因組中相關(guān)基因的信息較為明確(允許個(gè)別重要候選基因在豬基因組中無(wú)相關(guān)信息，這樣就需要在本研究中系統(tǒng)開(kāi)展該基因的工作)。如果小鼠或人的相關(guān)基因產(chǎn)物的抗體在豬胚胎研究中可用則直接借用，如基于小鼠或人的抗體效果不佳，則將通過(guò)釣取小型豬的基因，體外原核表達(dá)蛋白后自制相應(yīng)單克隆抗體；原為雜交的探針將根據(jù)豬基因組信息合成。.小型豬早期胚胎發(fā)育模式及胚胎發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因篩選小型豬發(fā)情配種當(dāng)日定位第0天，實(shí)驗(yàn)將收集第1天至第20天的體內(nèi)胚胎，間隔1天取樣，每個(gè)階段至少收集2頭個(gè)體的胚胎；所獲得的胚胎1/3用于發(fā)育模式研究，1/3用于候選基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫組化研究，1/3用于候選基因的原位雜交研究；候選基因根據(jù)發(fā)育模式、免疫組化以及原為雜交結(jié)果的比對(duì)分析最終確認(rèn)分化關(guān)鍵基因。.小型豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因功能研究小型豬早期發(fā)育關(guān)鍵基因篩選出后，根據(jù)相應(yīng)基因的信息構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體以及整合型RNAi載體，轉(zhuǎn)染小型豬胎兒成纖維細(xì)胞，通過(guò)核移植構(gòu)建上述基因過(guò)表達(dá)與擾低的胚胎，跟蹤胚胎的發(fā)育模式，并分析相關(guān)基因的表達(dá)狀況，探索這些基因在早期胚胎發(fā)育中的作用。.早期胚胎發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因的表觀遺傳調(diào)控根據(jù)小型豬早期胚胎分化基因時(shí)空表達(dá)譜的信息，收集相應(yīng)階段的小型豬胚胎，提取總RNA和DNA，通過(guò)real-timePCR、亞硫酸鹽測(cè)序和ChIP技術(shù)測(cè)定關(guān)鍵基因的表觀遺傳調(diào)控及其與基因表達(dá)的關(guān)系。.小型豬與其它品種豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)制比較在初步探明小型豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因及其調(diào)控模式后，選取具有代表性的關(guān)鍵基因以及基因發(fā)揮調(diào)控功能的關(guān)鍵階段來(lái)收集其它品種的豬胚胎，采用上述方案研究相應(yīng)基因的表達(dá)、功能及調(diào)控機(jī)制，最終與小型豬相應(yīng)研究結(jié)果比較獲得小型豬與其它品種豬早期胚胎發(fā)育模式及調(diào)控機(jī)制的差異資料。課題三：生殖相關(guān)小型豬模型的建立承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院；參加單位：吉林大學(xué)；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；課題負(fù)責(zé)人：賴(lài)良學(xué)；課題經(jīng)費(fèi)比例：31%；主要參加人員：周虛、郭新政、張明軍、劉朝明本課題的主要目標(biāo)是建立生殖發(fā)育研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值的生殖相關(guān)小型豬模型，圍繞這一目標(biāo)，我們選擇五指山和云南版納近交系小型豬這一目前公認(rèn)的最為理想的人類(lèi)疾病和生殖發(fā)育研究模型作為研究對(duì)象，在課題1和課題2對(duì)其最為基本的基因組學(xué)和常規(guī)生理生化數(shù)據(jù)進(jìn)行搜集整理的基礎(chǔ)上，結(jié)合我們已有的研究基礎(chǔ)，我們將采用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)這一目前最為先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因豬制作技術(shù)進(jìn)行一系列生殖相關(guān)小型豬模型的建立。1）.條件性去除生殖細(xì)胞小型豬模型的建立Tet-On誘導(dǎo)特異性去除生殖細(xì)胞小型豬模型的制備選擇雄性生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因（如Mvh）的啟動(dòng)子，構(gòu)建Tet-On系統(tǒng)的調(diào)控部分，制備轉(zhuǎn)基因小型豬M-Regulator。選擇雌性生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因（如Zp3）的啟動(dòng)子，構(gòu)建Tet-On系統(tǒng)的調(diào)控部分，制備轉(zhuǎn)基因小型豬F-Regulator。在Tet-On系統(tǒng)的效應(yīng)部分，插入白喉毒素A（diphtheriatoxinA，DTA）的表達(dá)序列，制備轉(zhuǎn)基因小型豬DTA-Responder。M-Regulator、F-Regulator和DTA-Responder小型豬交配產(chǎn)生的轉(zhuǎn)三基因小型豬“DTAOn-GermOut”，該豬在藥物Dox的誘導(dǎo)下可以劑量依賴(lài)性地破壞雄性或者雌性小型豬的生殖細(xì)胞。2.“DTAOn-GermOut”小型豬模型的檢測(cè)和利用研究該模型在Dox誘導(dǎo)后，雄性和雌性生殖細(xì)胞（精子和卵子）的存活狀態(tài)、生殖器官（睪丸和卵巢）的生理狀態(tài)、以及動(dòng)物個(gè)體的發(fā)育狀況。以該模型小型豬的囊胚作為制備嵌合體的受體胚胎，在嵌合體小型豬成長(zhǎng)過(guò)程中用Dox誘導(dǎo)去除受體小型豬來(lái)源的生殖細(xì)胞，然后交配產(chǎn)生子代小型豬，研究此種途徑獲得的子代小型豬攜帶特定基因的概率是否比一般途徑的高，這種方法是否可以提高從嵌合體獲得純合體小型豬的效率。以去除生殖細(xì)胞的小型豬為受體，研究干細(xì)胞移植治療的可能性和方法。2）.缺失抑制素a亞基的高繁殖力小型豬模型的建立本研究將通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)建立缺失抑制素a亞基基因的小型豬模型來(lái)探索通過(guò)修飾改造抑制素a亞基基因后能否提高動(dòng)物的繁殖力，這將為高繁殖力豬甚至其它哺乳動(dòng)物新品種的培育，為未來(lái)人類(lèi)疾病模型的建立積累新知識(shí)、提出新理論、尋找新思路并創(chuàng)建新方法。本項(xiàng)目將從以下三個(gè)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)：建立缺失抑制素a亞基基因的小型豬模型；（結(jié)合基因敲除和體細(xì)胞克隆技術(shù)）；抑制素a亞基基因缺失小型豬的有效性和安全性檢測(cè)；（檢測(cè)不同發(fā)育階段和不同后代中抑制素a亞基基因缺失小型豬的生產(chǎn)性能，繁殖性能，各項(xiàng)生理指標(biāo)，生殖器官及其它器官的發(fā)育及病理變化）；揭示抑制素基因與其它基因在調(diào)節(jié)動(dòng)物生殖活動(dòng)中的互作關(guān)系；（研究正常和缺失抑制素基因小型豬生殖器官的轉(zhuǎn)錄組變化）；本項(xiàng)目技術(shù)路線：

小型豬抑制素<1亞基基因的扶得IRT卩CRH■I『敲除抑制素a亞基基因載體的構(gòu)建I細(xì)胞培養(yǎng)J譽(yù)染」i敲除抑制素。亞基基因小型豬胚胎成纖維細(xì)胞的建立1核移植I：獲得敲除抑制素a獲得敲除抑制素a亞基基因小型豬模型一小型豬模型病理學(xué)評(píng)估—>小型精模型轉(zhuǎn)錄組學(xué)評(píng)估3)Oct4-GFP轉(zhuǎn)基因克隆豬模型的制備豬Oct4啟動(dòng)子區(qū)域的克隆與序列分析。構(gòu)建豬Oct4-GFP報(bào)告載體poct4-GFP-neo載體將載體pEGFP-N2中的CMV啟動(dòng)子替換成豬Oct4啟動(dòng)子，構(gòu)建poct4-GFP-neo載體。豬Oct4啟動(dòng)的有效性及特異性的驗(yàn)證。質(zhì)粒poct4-GFP-neo轉(zhuǎn)染豬IPS細(xì)胞，同時(shí)以pcmv-GFP為對(duì)照，觀察兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后GFP在IPS細(xì)胞及feeder細(xì)胞的表達(dá)。證明豬Oct4啟動(dòng)子調(diào)控的GFP僅在IPS細(xì)胞表達(dá)。從而驗(yàn)證其有效性及特異性。線性化載體poct4-GFP-neo，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。以poct4-GFP-neo轉(zhuǎn)基因豬胚胎纖維細(xì)胞為供體，本細(xì)胞核移植獲得轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆胚胎。觀察胚胎不同時(shí)期GFP表達(dá)，并利用免疫熒光技術(shù)同步觀察內(nèi)源性O(shè)ct4基因的表達(dá)。胚胎移植，獲得oct4-GFP轉(zhuǎn)基因克隆豬?？寺∝i的鑒定和檢測(cè)。4）生殖細(xì)胞組織特異性表達(dá)的CRE豬模型的制備采用生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)子（piwill基因啟動(dòng)子）構(gòu)建組織特異性表達(dá)CRE的載體；線性化后轉(zhuǎn)染小型豬成纖維細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，制備克隆豬；所獲轉(zhuǎn)基因克隆豬與本課題組已獲得的能報(bào)告CRE表達(dá)的轉(zhuǎn)基因豬雜交；將獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，用于分析示蹤生殖細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程和軌跡研究。piwill基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶載體的構(gòu)建小型豬胎兒成纖維細(xì)胞制備遺傳修飾成纖維細(xì)胞制備核移植，胚胎移植,制備遺傳修飾克隆豬克隆豬表達(dá)Cre的組織分析，遺傳修飾克隆豬生理生化

指標(biāo)分析課題四：發(fā)育相關(guān)小型豬模型的建立承擔(dān)單位：昆明醫(yī)學(xué)院、吉林大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院；課題負(fù)責(zé)人：周新富；課題經(jīng)費(fèi)比例：30%；主要參加人員：李子義、陸地、張學(xué)明、趙本田分別建立幾種在神經(jīng)發(fā)育和心血管系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值的小型豬模型，為哺乳動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究提供重要的研究工具。1).成熟BDNF及其前體轉(zhuǎn)基因小型豬模型的建立以基因修飾技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ)建立僅表達(dá)成熟BDNF的豬系：和BDNF前體基因突變的豬系，用于研究成熟的BDNF和proBDNF對(duì)神經(jīng)及其他器官發(fā)育的影響。首先，將BDNF的前體域敲除，并通過(guò)外源基因過(guò)表達(dá)技術(shù)讓豬僅表達(dá)成熟的BDNF但不表達(dá)前體域。另外，將BDNF前體Furin降解點(diǎn)變異掉，這樣該前體就不會(huì)被Furin酶及tPA酶降解為成熟的BDNF。結(jié)果使小豬只主要表達(dá)BDNF前體而非成熟BDNF。2).運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育小型豬模型建立以有絲分裂后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的標(biāo)記基因HB9基因的5'端完整調(diào)控區(qū)驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白基因(GFP)的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染獲得HB9-GFP轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細(xì)胞，最終以該體細(xì)胞為供體應(yīng)用核移植技術(shù)獲得HB9-GFP轉(zhuǎn)基因克隆豬，用于直觀性的研究運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育及功能。3)ISL1+心臟前體細(xì)胞發(fā)育小型豬模型建立首先從Cre介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)基因豬中獲得胚胎成纖維細(xì)胞。通過(guò)電穿孔方法轉(zhuǎn)染敲入載體獲得ISL1-CreERT2基因敲入成纖維細(xì)胞。再通過(guò)核移植技術(shù)獲得ISL1-CreERT2基因敲入豬。ISL1-CreERT2:EGFP豬獲得后，再與EGFP指示轉(zhuǎn)基因豬回交。檢測(cè)這些雙雜合子豬在不同時(shí)期的重組效率。向孕豬注射入tamoxifen，檢測(cè)ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心臟發(fā)生時(shí)期的表達(dá)情況，確定IS1+前體細(xì)胞對(duì)不同心臟細(xì)胞細(xì)胞家系的作用。通過(guò)體內(nèi)跟蹤方法，明確豬心臟發(fā)生過(guò)程中ISL1+心臟前體發(fā)育如何分化成系。確定在心臟月牙期ISL1是不是僅僅標(biāo)記在第二心區(qū)（SHF）,明確ISL1在從心臟月牙期到四腔期是一種處于激活狀態(tài)還是在分化過(guò)程中需要重激活。分離出大量ISL1+心臟前體，以豬為動(dòng)物模型測(cè)試其在臨床前研究中的治療可行性。4）WT1-EGFP腎臟、生殖腺發(fā)育小型豬模型建立①WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因小型豬模型建立及WT1基因組織表達(dá)與功能研究構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的WT1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞系，通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)，獲得WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因小型豬動(dòng)物模型，直觀性研究?jī)?nèi)源性WT1基因在胚胎和成體時(shí)期各組織器官內(nèi)的表達(dá)情況。②小型豬WT1基因在腎臟、生殖腺發(fā)育中的重要作用通過(guò)RT-PCR方法，檢測(cè)其他腎臟發(fā)育相關(guān)基因Pax-2、GDNF等在腎臟的表達(dá)情況；檢測(cè)其他生殖腺發(fā)育相關(guān)基因SRY、SF1在睪丸和卵巢中的表達(dá)情況；構(gòu)建WT1基因高表達(dá)載體和表達(dá)沉默載體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表達(dá)。③小型豬WT1基因表觀遺傳修飾研究運(yùn)用甲基化特異性PCR檢測(cè)小型豬腎臟WT1基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)，并且運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(CHIP)分別檢測(cè)WT1基因組蛋白乙?；图谆癄顟B(tài)。使用去乙?；敢种苿┒∷徕c處理小型豬克隆胚胎，運(yùn)用CHIP技術(shù)，比較克隆胚胎和丁酸鈉處理克隆胚胎WT1基因啟動(dòng)子序列組蛋白H3、H4乙?；癄顟B(tài)，同時(shí)分別運(yùn)用Real-timePCR技術(shù)和WesternBlot技術(shù)檢測(cè)克隆胚胎和丁酸鈉處理克隆胚胎WT1基因mRNA水平和蛋白水平表達(dá)情況。創(chuàng)新性與特色本項(xiàng)目探討影響國(guó)計(jì)民生的的重大科學(xué)問(wèn)題。項(xiàng)目中的四個(gè)子課題既相互獨(dú)立，又交叉互補(bǔ)。這些課題既是有關(guān)研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優(yōu)勢(shì)力量，對(duì)生殖發(fā)育重要?jiǎng)游锬Ｐ徒⒅械暮诵膯?wèn)題進(jìn)行多側(cè)面的合作研究。本題目的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：本項(xiàng)目探討的問(wèn)題是國(guó)際前沿的科學(xué)問(wèn)題，因此保證了項(xiàng)目的創(chuàng)新性。本項(xiàng)目的選題涉及小型豬基因組學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控、生殖發(fā)育相關(guān)模型的建立等科學(xué)問(wèn)題。將基礎(chǔ)科學(xué)與實(shí)際應(yīng)用相結(jié)合，力爭(zhēng)在解答基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題的同時(shí)，發(fā)展新的動(dòng)物模型。本項(xiàng)目在充分利用課題組已建立的基因組學(xué)研究平臺(tái)，轉(zhuǎn)基因克隆豬研究平臺(tái)，生物信息學(xué)研究平臺(tái)的基礎(chǔ)上，建立小型豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，分析小型豬基因組特征和早期胚胎基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)理，填補(bǔ)小型豬研究領(lǐng)域的空白。本項(xiàng)目著眼于技術(shù)創(chuàng)新,通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合多種體細(xì)胞基因修飾技術(shù)，建立轉(zhuǎn)基因豬和基因打靶豬的技術(shù)體系，建立多種生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)中具有重要應(yīng)用價(jià)值的新型動(dòng)物模型，為生物醫(yī)學(xué)研究提供新的模型工具，必將極大的促進(jìn)生殖發(fā)育研究的深入，加速其研究成果在人類(lèi)醫(yī)療事業(yè)上的早日應(yīng)用。本課題選用我國(guó)自行培育的高度近交系版納小型豬和五指山小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顯示了獨(dú)特的資源優(yōu)勢(shì)和特色?？尚行苑治霰卷?xiàng)目的總體方案是切實(shí)可行的。本項(xiàng)目提出的主要科學(xué)問(wèn)題和研究目標(biāo)不僅具有理論和實(shí)際依據(jù)，而且都是該領(lǐng)域前沿性和關(guān)鍵性的問(wèn)題。豬的基因組學(xué)及生殖發(fā)育豬模型的研究正處于發(fā)展的起步階段，體細(xì)胞克隆也正處于平緩發(fā)展的時(shí)期，這對(duì)我國(guó)來(lái)講是個(gè)難得的走向?qū)W術(shù)前沿的一個(gè)重大機(jī)遇。近年來(lái)，本次項(xiàng)目申請(qǐng)參與單位積極主動(dòng)參加國(guó)內(nèi)外召開(kāi)的該領(lǐng)域相關(guān)會(huì)議，與該領(lǐng)域的著名學(xué)者、同行交流了解國(guó)內(nèi)外動(dòng)態(tài)和發(fā)展趨勢(shì)，并與國(guó)內(nèi)外多家科研機(jī)構(gòu)建立了良好合作關(guān)系。項(xiàng)目申請(qǐng)參與單位均有多年從事生殖生物技術(shù)、發(fā)育生物學(xué)、胚胎工程、分子生物學(xué)等方面研究的經(jīng)歷，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人也都有在國(guó)外知名實(shí)驗(yàn)室從事科研工作的閱歷。我們聯(lián)合了該領(lǐng)域取得突出成績(jī)的國(guó)內(nèi)優(yōu)秀中青年科學(xué)工作者。他們都是經(jīng)歷了在國(guó)外相關(guān)領(lǐng)域知名實(shí)驗(yàn)室從事科學(xué)研究，學(xué)成回國(guó)的年富力強(qiáng)的科研人員，也都有參加過(guò)國(guó)家重大、重點(diǎn)課題項(xiàng)目的經(jīng)歷，具備承擔(dān)國(guó)家項(xiàng)目并取得重要突破的素質(zhì)。研究課題組成員有深厚的理論知識(shí)與豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),熟悉當(dāng)前的研究現(xiàn)狀及方法手段,對(duì)本課題的研究具有較強(qiáng)的掌控及應(yīng)變能力,能保證課題的順利完成。承擔(dān)單位有良好的研究條件和研究基礎(chǔ)，并已具備了相當(dāng)規(guī)模并取得了很好的科研成果，已具備的條件和研究?jī)?yōu)勢(shì)將保證本課題的順利實(shí)現(xiàn)和圓滿完成。有國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、本研究所涉及的儀器設(shè)備和材料均有保障。已經(jīng)在克隆領(lǐng)域獲得了國(guó)內(nèi)外矚目的成果：項(xiàng)目參與單位的主要人員近年來(lái)都在豬的體細(xì)胞克隆、家畜多能性干細(xì)胞、模式動(dòng)物胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞應(yīng)用及基礎(chǔ)研究方面獲得過(guò)成功,a-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶敲除克隆豬、國(guó)內(nèi)首例含多基因克隆豬、均在國(guó)內(nèi)外倍受關(guān)注。這將會(huì)為本項(xiàng)目的開(kāi)展及時(shí)提供最新信息、深入開(kāi)展國(guó)際合作，把握最新動(dòng)向提供便利。

四、年度計(jì)劃硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)1對(duì)版納微型豬近交系和五指山小1完成版納微型豬近交系和五指山型豬近交系進(jìn)行全基因組測(cè)序；小型豬近交系的全基因組測(cè)序；2測(cè)定小型豬生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，建立數(shù)2建立小型豬生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。據(jù)庫(kù)；3成功建立和優(yōu)化豬體外受精和早3建立和優(yōu)化豬體外受精和早期胚期胚胎培養(yǎng)條件,獲得豬早期培養(yǎng)胎培養(yǎng)條件,對(duì)豬不同階段的早期發(fā)育的基因表達(dá)數(shù)據(jù)；胚胎進(jìn)行取材用測(cè)序和芯片分析早4獲得轉(zhuǎn)M-Regulator單基因小型第期胚胎基因表達(dá)狀況包括編碼蛋白豬；的基因和miRNA基因：5獲得生殖細(xì)胞特異性啟動(dòng)子Cre重4選擇雄性生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因（如Mvh）的啟動(dòng)子，構(gòu)建Tet-On組酶的轉(zhuǎn)基因克隆豬5頭以上；年6全面分析小型豬抑制素a亞基基因系統(tǒng)的調(diào)控部分，制備轉(zhuǎn)基因小型豬結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建敲除小型豬抑制素aM-Regulator；亞基基因載體。5豬Oct4啟動(dòng)子區(qū)域的克隆與序列分析；轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建，遺傳修飾成纖維細(xì)胞制備與遺傳修飾豬胚胎制7構(gòu)建出各突變表達(dá)載體；8建立相應(yīng)轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系；9獲得ISLl-CreERT2基因敲入成纖備，獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因克隆豬；維細(xì)胞10.構(gòu)建WT1-EGFP融合表達(dá)載體

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)6小型豬抑制素a亞基基因全長(zhǎng)序列并建立WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因豬耳尖成的獲得及信息學(xué)分析構(gòu)建敲除小型纖維細(xì)胞系；豬抑制素a亞基基因載體；11.檢測(cè)小型豬腎臟、生殖腺各發(fā)育7APP/PS1-/-，a-synuclein-/-，相人基因在腎臟和生殖腺的mRNAS0D1-/-，matureBDNF-/-、表達(dá)水平；揭示W(wǎng)T1基因和其它腎pro-BDNF-/-等突變表達(dá)載體的構(gòu)建臟、生殖腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的8突變表達(dá)載體植入干細(xì)胞核建立各轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系及相應(yīng)生理生化特征研究。9從Cre介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)基因豬中獲得胚胎成纖維細(xì)胞。通過(guò)電穿孔方法轉(zhuǎn)染敲入載體獲得ISL1-CreERT2基因敲入成纖維細(xì)胞。10.構(gòu)建WT1-EGFP融合表達(dá)載體并建立WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因豬耳尖成纖維細(xì)胞系；11小型豬WT1基因在腎臟、生殖腺發(fā)育形成中的重要作用①取成年小型豬腎臟、生殖腺，僉測(cè)Pax-2、GDNF,SRY、SF1的mRNA相關(guān)機(jī)制。

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)水平表達(dá)；②建立相應(yīng)上皮細(xì)胞系，設(shè)計(jì)RNAi序列，構(gòu)建WT1基因沉默載體并轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞系，檢測(cè)Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表達(dá)情況。1對(duì)小型豬的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組/1完成測(cè)序結(jié)果分析找出與人類(lèi)疾基因變異/多態(tài)性、基因調(diào)控、基因病相關(guān)基因在小型豬里的直系同源挖掘等多個(gè)方向分析進(jìn)行全基因組基因，建立小型豬全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。第解讀，進(jìn)行跨物種基因注釋。2建立小型豬生理生化數(shù)據(jù)庫(kù)。2測(cè)定小型豬生理生化指標(biāo)包括血常規(guī)指標(biāo)，血液生化指標(biāo)、臨床生理3獲得一批對(duì)早期胚胎發(fā)育重要的二候選基因，深入了解特定基因的功指標(biāo)、尿液糞便指標(biāo)、激素指標(biāo)和微能。年生物指標(biāo)等，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。4獲得轉(zhuǎn)F-Regulator單基因小型3對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析篩選對(duì)早期培豬；養(yǎng)發(fā)育重要的候選基因幵始詳細(xì)分5獲得豬Oct4-GFP報(bào)告載體析它們的功能。poct4-GFP-neo載體；

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)4選擇雌性生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因（如Zp3的啟動(dòng)子構(gòu)建Tet-On系統(tǒng)的調(diào)控部分，制備轉(zhuǎn)基因小型豬F-Regulator；5將載體pEGFP-N2中的CMV啟動(dòng)子替換成豬Oct4啟動(dòng)子，構(gòu)建poct4-GFP-neo載體；6繼續(xù)制備生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因克隆豬；轉(zhuǎn)基因克隆豬生理指標(biāo)檢測(cè)與基因表達(dá)分析對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因豬與本課題組前期研究過(guò)程中構(gòu)建的CRE表達(dá)報(bào)道豬雜交，驗(yàn)證CRE的細(xì)胞特異性表達(dá)。7將缺失抑制素基因a亞基的表達(dá)載體線性化后轉(zhuǎn)染小型豬成纖維細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克?。?利用細(xì)胞核移植技術(shù)，構(gòu)建MND轉(zhuǎn)基因小型豬疾病模型及只表達(dá)matureBDNF或pro-BDNF轉(zhuǎn)基因小型豬模型；將只表達(dá)matureBDNF6獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶活性高的轉(zhuǎn)基因克隆豬5頭以上;7獲得缺失抑制素基因a業(yè)基表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆成纖維細(xì)胞；8成功建立構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小型豬疾病模型的技術(shù)方法獲得各種穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小型豬疾病模型供接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)；9獲得ISLl-CreERT2基因敲入豬10構(gòu)建WT1基因高表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后揭示W(wǎng)T1基因和其它腎臟、生殖腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)機(jī)制；11建立檢測(cè)基因DNA甲基化狀態(tài)的甲基化特異性PCR方法；建立檢測(cè)基因組蛋白乙酰化和甲基化狀態(tài)的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）；揭示W(wǎng)T1基因表達(dá)和組蛋白乙酰化、甲基化及DNA甲基化的相關(guān)性。

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)或pro-BDNF轉(zhuǎn)基因小型豬模型與其它疾病模型雜交獲得各種基因型的豬系；9.通過(guò)核移植技術(shù)獲得ISLl-CreERT2基因敲入豬。10小型豬WT1基因在腎臟、生殖腺發(fā)育形成中的重要作用建立相應(yīng)上皮細(xì)胞系，構(gòu)建WT1基因高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞，檢測(cè)Pax-2、GDNF，SRY、SF1的表達(dá)情況。11小型豬WT1基因表觀遺傳修飾研究巢式甲基化特異性PCR方法檢測(cè)WT1基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)；染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）檢測(cè)成年小型豬腎臟WT1基因組蛋白乙?；癄顟B(tài)；染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）檢

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)測(cè)小型豬腎臟WT1基因組蛋白甲基化狀態(tài)。1完善小型豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建1完成論文撰寫(xiě)，就小型豬基因組設(shè)，整理數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文研究發(fā)表論文5-10篇。其中影響因2測(cè)定小型豬繁殖性能指標(biāo)建立數(shù)子大于5的不少于2篇。第據(jù)庫(kù)。。2建立小型豬繁殖性能數(shù)據(jù)庫(kù)。3研究候選基因在豬早期胚胎的功3獲得特定基因在豬早期胚胎發(fā)冃三能。中的功能。發(fā)表文章2-3篇，培養(yǎng)研4在Tet-On系統(tǒng)的效應(yīng)部分，插入究生2-3名年白喉毒素A(diphtheriatoxinA,4為犬得轉(zhuǎn)DTA-Responder單基因小DTA）的表達(dá)序列，制備轉(zhuǎn)基因小型豬；型豬DTA-Responder；5驗(yàn)證Oct4啟動(dòng)子的有效性及特異5用質(zhì)粒poct4-GFP-neo轉(zhuǎn)染豬IPS性；

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)細(xì)胞/同時(shí)以pcmv-GFP為對(duì)照，觀察兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后GFP在IPS細(xì)胞及feeder細(xì)胞的表達(dá)。證明豬Oct4啟動(dòng)子調(diào)控的GFP僅在IPS細(xì)胞表達(dá)。從而驗(yàn)證其有效性及特異性。6以前二年實(shí)驗(yàn)中確定的生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre，并具有較高活性的轉(zhuǎn)基因克隆豬繁育，制備純合子豬；7以缺失抑制素基因a亞基表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆成纖維細(xì)胞為供體經(jīng)體細(xì)胞核移植獲得轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆胚胎；8轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)特征研究；9ISLl-CreERT2:EGFP豬獲得后，再與EGFP指示轉(zhuǎn)基因豬回交。檢測(cè)這些雙雜合子豬在不同時(shí)期的重組效率，向孕豬注射入tamoxifen，檢測(cè)ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心臟發(fā)生時(shí)期的表達(dá)情況，確定IS1+前體細(xì)胞對(duì)不同心臟細(xì)胞細(xì)胞6獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的純合子豬10頭以上；7獲得缺失抑制素基因a業(yè)基表達(dá)載體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆胚胎；8獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)數(shù)據(jù)；發(fā)表SCI論文2-3篇。培養(yǎng)碩士、博士研究生2-3名。9檢測(cè)ISL1-CreERT2控制下的EGFP在不同心臟發(fā)生時(shí)期的表達(dá)情況，確定IS1+前體細(xì)胞對(duì)不同心臟細(xì)胞細(xì)胞家系的作用；10了解克隆小型豬不同胚胎時(shí)期和成體各器官的WT1基因表達(dá)情況；發(fā)表SCI論文1-2篇。培養(yǎng)碩士研究生和博士研究生2-3名。

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)家系的作用。10WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因小型豬模型建立及WT1基因組織表達(dá)與功能研究運(yùn)用體細(xì)胞核移植技術(shù)，制備WT1-EGFP轉(zhuǎn)基因克隆小型豬；熒光顯象系統(tǒng)下通過(guò)EGFP的表達(dá)上匕較克隆小型豬不同胚胎時(shí)期各器官和成體各器官的WT1基因表達(dá)，深入了解和研究WT1基因在各器官執(zhí)行的作用及功能。1.測(cè)定小型豬免疫學(xué)指標(biāo)，建立數(shù)1.建立小型豬免疫學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。據(jù)庫(kù)；2.獲得豬早期胚胎的表觀遺傳修飾第2?研究豬早期胚胎的表現(xiàn)遺傳修飾狀況。發(fā)表文章2-3篇，其中至少一狀況；篇影響因子大于5，培養(yǎng)研究生2-3四3將M-Regulator、F-Regulator和名；DTA-Responder轉(zhuǎn)單基因小型豬交3獲得轉(zhuǎn)一基因豬初步獲得生殖細(xì)年配產(chǎn)生轉(zhuǎn)三基因小型豬“DTA胞去除后的表型；On-GermOut”，研究生殖細(xì)胞去4經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)除后的表型；poct4-GFP-neo基因細(xì)胞克??；獲得4線性化載體poct4-GFP-neo，脂質(zhì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)poct4-GFP-neo基因體細(xì)胞克

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)體轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克??；以poct4-GFP-neo轉(zhuǎn)基因豬陽(yáng)性胚胎成纖維細(xì)胞為供體經(jīng)體細(xì)胞核移植獲得轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆胚胎。觀察胚胎不同時(shí)期GFP表達(dá)，并利用免疫熒光技術(shù)同步觀察內(nèi)源性O(shè)ct4基因的表達(dá)。5對(duì)獲得的純合子轉(zhuǎn)基因豬與本課題組前期研究過(guò)程中構(gòu)建的CRE表達(dá)報(bào)道豬雜交，驗(yàn)證CRE的細(xì)胞特異性表達(dá)建立所獲轉(zhuǎn)基因小型豬的遺傳、生理生化等相關(guān)指標(biāo)；6胚胎移植，獲得缺失抑制素基因a亞基陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因克隆豬?？寺∝i的鑒定和檢測(cè)；7MatureBDNF、proBDNF以及MND轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)特征研究；8通過(guò)體內(nèi)跟蹤方法,明確豬心臟發(fā)生過(guò)程中ISL1+心臟刖體發(fā)育如何隆胚胎；5獲得生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶活性高的轉(zhuǎn)基因克隆豬10頭以上，建立所獲轉(zhuǎn)基因小型豬的遺傳、生理生化等相關(guān)指標(biāo)；6獲得缺失抑制素基因a業(yè)基的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因克隆豬；7了解MND、matureBDNF、proBDNF轉(zhuǎn)基因小型豬模型不同胚胎時(shí)期和成體個(gè)器官的基因表達(dá)情況;發(fā)表SCI論文2-3篇。培養(yǎng)碩士、博士研究生2-3名。8明確豬心臟發(fā)生過(guò)程中ISL1+心臟刖體發(fā)育如何分化成系，明確ISL1在從心臟月牙期到四腔期是一種處于激活狀態(tài)還是在分化過(guò)程中需要重激活；9丁酸鈉對(duì)克隆胚胎整體組蛋白乙?；降挠绊?；WT1基因H3、H4組蛋白乙?；瘜?duì)克隆胚胎發(fā)育的影響。

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)分化成系。確定在心臟月牙期ISL1疋不疋僅僅標(biāo)記在第—心區(qū)（SHF）,明確ISL1在從心臟月牙期到四腔期是一種處于激活狀態(tài)還是在分化過(guò)程中需要重激活。9WT1基因組蛋白乙酰化對(duì)體細(xì)胞克隆小型豬胚胎的影響丁酸鈉處理供體細(xì)胞，卵母細(xì)胞及克隆胚胎后胚胎發(fā)育率及H3K14免疫熒光染色后整體組蛋白乙酰化水平檢測(cè)；CHIP技術(shù)檢測(cè)克隆胚胎和丁酸鈉處理克隆胚胎WT1基因啟動(dòng)子序列組蛋白H3和H4的K位點(diǎn)乙?；癄?/p>

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)1.測(cè)定小型豬遺傳背景，建立數(shù)據(jù)1.建立小型豬遺傳背景數(shù)據(jù)庫(kù)，整庫(kù)。整合各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，建立小型豬生合建立小型豬生殖發(fā)育綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。殖發(fā)育綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。2.獲得早期培養(yǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)2.構(gòu)建早期胚胎發(fā)育關(guān)鍵基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及表觀遺傳調(diào)控狀況。發(fā)表控網(wǎng)絡(luò)以及表觀遺傳調(diào)控狀況。影響因子大于5的文章2篇以上培3在“DTAOn-GermOut”小型豬模養(yǎng)研究生4-5名型基礎(chǔ)上研究該模型在Dox誘導(dǎo)后，3獲得“DTAOn-GermOut”小型豬雄性和雌性生殖細(xì)胞（精子和卵子）模型在經(jīng)Dox誘導(dǎo)后，精子和卵子第的存活狀態(tài)、生殖器官（睪丸和卵巢）的存活狀態(tài)、睪丸和卵巢的生理狀的生理狀態(tài)、以及動(dòng)物個(gè)體的發(fā)育狀態(tài)、以及動(dòng)物個(gè)體的發(fā)育狀況相關(guān)數(shù)五況；據(jù)；年4胚胎移植，獲得oct4-GFP轉(zhuǎn)基因4獲得oct4-GFP轉(zhuǎn)基因克隆豬；克隆豬?？寺∝i的鑒定和檢測(cè)；5獲得生殖細(xì)胞條件性基因敲除豬；5將所獲得的豬與本課題組其他實(shí)6抑制素a亞基基因缺失小型豬牛驗(yàn)過(guò)程中建立的基因含loxp的豬雜殖生理活動(dòng)和生殖內(nèi)分泌的變化各交，獲得生殖細(xì)胞條件性基因敲除個(gè)器官的發(fā)育能力和可能的病理變豬，確定條件性敲除的基因在生殖細(xì)化數(shù)據(jù)；胞及生殖過(guò)程中的作用；7年共培養(yǎng)研究生15名，發(fā)表SCI6在建立的小型豬模型的基礎(chǔ)上研論文15篇；究抑制素a亞基基因缺失小型豬生8提出matureBDNF、proBDNF對(duì)

硏究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)殖生理活動(dòng)和生殖內(nèi)分泌的變化各個(gè)器官的發(fā)育能力和可能的病理變化；研究正常和缺失抑制素a亞基基因小型豬生殖器官的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化。7總結(jié)數(shù)據(jù)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文，提交報(bào)告，完成課題收尾工作。8研究matureBDNF及pro-BDNF對(duì)AD、PD、MND疾病發(fā)生、發(fā)展的影響，進(jìn)而確定用BDNF還是其前體分子pro-BDNF對(duì)此類(lèi)疾病進(jìn)行干預(yù)；9分離出大量ISL1+心臟前體，以豬為動(dòng)物模型測(cè)試其在臨床刖研究中的治療可行性；10總結(jié)數(shù)據(jù)，補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文提交報(bào)告完成課題收尾工作。11WT1基因組蛋白乙酰化對(duì)體細(xì)胞克隆小型豬胚胎的影響①Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)克隆胚胎和丁酸鈉處理克隆胚胎不同胚胎發(fā)此類(lèi)疾病的作用及相應(yīng)的干預(yù)方案；9獲得在臨床刖研究中具有定的治療可行性的