乳酸菌的研究進展

乳酸菌的研究進展

蘑菇是一個常見的名字，可以通過發(fā)酵過程產生大量的乳化酸。這類細菌在自然界分布廣泛,可寄居于人和各種動物的腸道及其它器官內。在土壤、植物根部和許多人類食品、動物飼料,還有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些臨床樣品中都發(fā)現(xiàn)有乳酸菌的存在。乳酸菌在與人類生活密切相關的工業(yè)、農業(yè)和醫(yī)藥等重要領域有很高應用價值。相當多的乳酸菌對人、畜健康起著有益的作用。乳酸菌主要包括23個屬,其中與分類密切相關的有革蘭陽性兼性厭氧球菌中的乳球菌屬(Lactococcus),革蘭陽性無芽胞桿菌中的乳桿菌屬(Lactobacillus)以及不規(guī)則的專性厭氧菌中的雙歧桿菌(Bifidobacterium)。本文對乳酸桿菌及雙歧菌基因工程表達系統(tǒng)的研究進展綜述如下。1乳酸桿菌質?；驒z測乳桿菌在農業(yè)、食品領域具有重大的經濟意義以及對動物和人體健康公認的重要性,越來越引起人們的關注。幾個世紀以來,乳桿菌作為重要的益生菌已廣泛地應用于食品及飲料加工業(yè),其生物學特性為棒狀,厭氧或微需氧,屬非致病菌。以乳桿菌作為發(fā)酵菌的食品工業(yè)所創(chuàng)造出的經濟價值占全球總的發(fā)酵類食品的20%。同時乳桿菌也被廣泛用于腸、肉類食品的加工和保鮮。乳桿菌通過重建腸道菌群平衡,從而有利于人類及某些動物宿主恢復并提高健康狀態(tài)。對于其發(fā)揮作用的機制現(xiàn)已研究得較為明確,主要有以下幾個方面:①控制腸道感染;②增加某些食物的營養(yǎng)價值;③控制血清膽固醇水平;④改善乳糖代謝;⑤誘導體內特異性及非特異性免疫;⑥抗腫瘤活性。有關它的選種、生物學特性、代謝、生理、遺傳等方面的研究,以及以改造這些菌株特性為目的的研究近年來逐漸增加。通過在大腸桿菌中克隆和表達DNA片段,再借助轉化,將外源性DNA導入乳桿菌中,使之穩(wěn)定地在乳桿菌中復制和表達。目前,幾乎所有的乳桿菌中都可以進行轉化。最近研究方法已經發(fā)展到將基因插入到染色體特定部位,使基因有目的地突變。乳桿菌具有十分重要的生理作用及經濟價值,因此近幾十年來已廣泛開展了對其定性、篩選、代謝、生理學及基因方面的研究,尤其是應用基因工程手段已將研究由原來的重點定性分類階段轉移到穩(wěn)定轉化及改善乳桿菌生物學性狀的重點上來。根據(jù)一系列復制子構建的具廣泛宿主范圍的質粒載體系統(tǒng)已十分成功地轉化乳酸菌并表達內源及外源基因。但是與醫(yī)藥微生物基因工程研究相比,乳酸桿菌基因工程進展較慢,其基因工程進展如下:1.1乳桿菌質粒自從1976年Chassy首次發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬質粒以來,人們陸續(xù)從植物、肉、臘腸、發(fā)酵劑、胃腸道和菌株中分離出各種不同的質粒。許多乳桿菌帶有1個或多個質粒。但保加利亞乳桿菌不存在內源性質粒是1個普遍存在的規(guī)律,而且對外來的自我復制的染色體外物質具有相對抵抗性。用DNA-DNAc雜交和/或核苷酸序列分析證實,各種質粒之間具有不同程度的同源性,從而說明質粒間的橫向傳遞和重組是相當頻繁的。雖然質粒普遍存在乳桿菌中,但對這些質粒的功能了解極少,這一點不同于乳球菌。最近幾年開展了有關質粒與細菌特性關系的廣泛研究,從中發(fā)現(xiàn)了質粒與某些表型,如抗藥性,N-乙酰氨基葡萄糖減緩酸的形成,糖苷的代謝、糖代謝、氨基酸代謝、細菌素產生與免疫、合成粘膜相關外,乳桿菌的大多數(shù)質粒,尤其是小質粒都是隱蔽性的。1.2乳酸桿菌質粒乳酸桿菌的許多種類中均發(fā)現(xiàn)有質粒的存在。最早在1976年由Chassy及其同事發(fā)現(xiàn)。分離得到的質粒菌株來源于植物、肉類、青儲飼料,發(fā)酵生面及消化道。研究中發(fā)現(xiàn),很多種類的乳桿菌均具有1個或多個質粒譜。WangTT等研究發(fā)現(xiàn)約有38%的乳酸桿菌中含有大小不等的質粒,約在1.2~150kb之間。且數(shù)量各異,1個或多個。小的質粒同其他革蘭陽性菌的線型質粒具有高度的相似性。一些乳桿菌質粒復制子宿主范圍廣泛,因而可在其他種類的革蘭陽性菌及大腸桿菌中發(fā)揮作用。但大多數(shù)乳桿菌質粒均為隱蔽型。但有些質粒編碼功能已經明確,并已應用于乳桿菌的鑒定、定型、載體構建及修飾中。不同的研究者得到的質粒檢測結果也不同。造成這個差異的關鍵在于不同的質粒提取方法。同時菌種來源不同也是一個方面。而Ruiz-Barba等在35株分離自橄欖的乳桿菌中均發(fā)現(xiàn)有不同大小的質粒存在。其中許多質粒的分子量較以前發(fā)現(xiàn)的要大得多。而分離自雞、小鼠腸道內的乳桿菌株,質粒陽性菌株卻較少。質粒也極少在保加利亞乳桿菌中發(fā)現(xiàn)。但保加利亞乳桿菌10(CultureCollectionatNorthCarolinaStateUniversity)和保加利亞乳桿菌M-878(MeijiInstituteofHealthScience,Japan)看來卻是個例外。由于乳桿菌中大部分質粒尤其是小質粒均屬隱蔽型的,因此對這些質粒的功能知之甚少。大多數(shù)的乳桿菌質粒表現(xiàn)出了分離穩(wěn)定性,尤其是小的隱性質粒較大質粒相對更加穩(wěn)定。現(xiàn)已有多種乳桿菌質粒被提出及鑒定,如分離自植物乳桿菌的pLB4,pC30il,pLD1,p8014-2和pA1;分離自戊糖乳桿菌的p353-2;分離自瑞士乳桿菌的pLJ1和希氏乳桿菌的pLAB1000。質粒的大小都非常相似,在1.9~3.5kb。質粒pLEB579(2.9kb)被成功地用電穿孔轉入來自于雞小腸的4株野生型乳桿菌。轉化效率雖低,但依然為食品級乳桿菌的基因工程奠定了基礎。在另外的一個研究中,重組質粒在誘導條件下在植物乳桿菌中高水平表達了細菌素。1.3質粒分離的穩(wěn)定性乳桿菌的大多數(shù)內源性質粒是穩(wěn)定的。一些菌株在實驗條件下傳代幾年,質粒也沒有明顯的變化。但也有一些例外,如肉中存在的某些乳桿菌,由質粒攜帶的麥芽糖利用特性,發(fā)現(xiàn)為不穩(wěn)定遺傳,在吖啶橙存在時,連續(xù)三次傳代,可引起全部質粒的丟失。類似的情況也見于嗜熱乳桿菌質粒相關的半乳糖利用標記和質粒攜帶的乳糖標記。一般來說,標記存在于40~80kb的大質粒上。大質粒的相對不穩(wěn)定性不同于小的隱蔽性質粒。在諸如植物乳桿菌、戊糖乳桿菌中,發(fā)現(xiàn)一些質粒在吖啶橙存在時,用亞致死溫度培養(yǎng)細菌時不能被消除,而上述條件在消除大多數(shù)細菌內源性質粒是很有效的。因這些小質粒的存在,在非實驗條件下,使帶質粒菌株具有超過無質粒株的選擇優(yōu)勢,盡管這些質粒并不帶有必須基因。1.4質粒結構從乳桿菌中分離的8個小的隱蔽性質粒的核苷酸序列已經測定。其中包括植物乳桿菌的plB4、pc30il、pl1、p3014.2、pA,戊糖乳桿菌的p353-2,德氏乳桿菌的pLJ1,希氏乳桿菌的pLAB1000,大小在1.9~3.5kb之間,結構及組成均非常相似。除pLJ1之外,所有質粒都是與革蘭陽性桿菌質粒復制蛋白(Rep)相似的一種蛋白。根據(jù)這些具有復制蛋白的功能特性,以及和其它質粒復制蛋白結構相似性,推測乳桿菌屬的小質粒是以滾環(huán)(RCR)方式進行復制的。它們復制可產生單股DNA中間體的積累。其中p1AB1000的最小復制區(qū)域已確定為1.5kb,根據(jù)其它乳桿菌質粒結構與革蘭陽性菌其它RCR質粒結構的相似性,推測所有其它乳桿菌質粒最小復制區(qū)域在大小上是類似的。1.5移動功能質粒pLB4和pLAB1000帶有1個推測參與質粒移動的42~46kDa的蛋白。這種蛋白并不影響DNA在乳桿菌中的復制。mob基因產物,可在特異性的RSA復合整合位點,進行質粒整合,使非接合性的移動成為可能。1.6DNA復制的控制質粒DNA復制是通過質粒攜帶的抑制子的負向控制機制來調節(jié)的。這些抑制子連于質粒特異性靶位點,以間接的方式控制質粒的復制。對許多質粒來說,反錄RNA(counter-transcripRNA或CTRNA)已經包括在質粒DNA復制控制機制中。其機制可能是降低轉錄水平,或抑制翻譯的起始。植物乳桿菌的plB4有一個基因,可能編碼阻遏蛋白?？梢钥刂苧epRNA的合成,并控制其自身的合成。2質粒的復制機制質粒是染色體外遺傳物質,普遍存在于各種不同的細菌中。近年來,由于發(fā)現(xiàn)越來越多重要細菌的特殊性質是由質粒編碼的,因此在各類細菌的遺傳研究中,質粒均受到了重視。腸道菌中的乳桿菌、擬桿菌、厭氧梭菌以及鏈球菌,在質粒方面的研究已有不同的進展,雙歧桿菌質粒的研究相對較少。1982年,Sgortati等對1461株共24個種的雙歧桿菌進行了質粒的檢測,發(fā)現(xiàn)四個種(總菌株數(shù)的20%)的雙歧桿菌即長雙歧桿菌、球雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌以及印度雙歧桿菌含有質粒。其中,長雙歧桿菌及星狀雙歧桿菌都含有多個質粒,而球狀雙歧桿菌及60%的印度雙歧桿菌只含有單個質粒。由于檢測方法及所檢測菌株的限制,雙歧桿菌其它種是否攜帶有質粒還不能確定,因此進一步的檢測還有待繼續(xù)進行。對含有質粒的各菌種的質粒電泳圖譜進行分析,發(fā)現(xiàn)各種都有各自特定的質粒帶型,Southern雜交也揭示了種內各質粒帶型的相關性。pNB1質粒是從短雙歧桿菌ATCC15698中分離得來,Bourget等已建立了該質粒的限制性內切酶圖譜,并對該質粒在菌體內的復制方式進行研究,由于在質粒復制過程中沒有檢測到單鏈環(huán)狀DNA,因此推測該質粒在菌體內是以θ復制方式進行復制而不是滾環(huán)復制。pMB1質粒是從長雙歧桿菌B2577菌株中分離出的隱性質粒,該質粒已有限制性內切酶圖譜。對其復制區(qū)域的研究也已開始,Marteuzzi等將pMB1質粒酶切后連接到質粒載體上,再轉化大腸桿菌以及枯草桿菌,結果只有在大腸桿菌中檢測到重組子。由于所使用載體的復制區(qū)域只能在大腸桿菌而不能在革蘭陽性菌中啟動,因而說明該隱性質粒的復制區(qū)域不能在枯草桿菌中啟動。質粒pNAC1(3538bp)、pNAC2(3684bp)和pNAC3(10,224bp)均分離自長雙歧。pNAC3是目前已測序的最大雙歧桿菌質粒。根據(jù)復制蛋白氨基酸序列的同源性可將雙歧桿菌質粒分為5組。有關雙歧桿菌質粒的復制機制還有待進一步深入研究,該研究將為最終建立以雙歧桿菌為克隆宿主的質粒載體打下基礎。研究表明,采用電穿孔技術可以將外源質粒成功地轉入雙歧桿菌。但質粒必須含有來源于放線菌科的復制子。利用長雙歧桿菌的pMB1復制子構建質粒載體pDG7,并可進一步將此質粒載體改建為質粒pDL141,pDGA7和pDCO7,分別用以表達熒光假單胞菌脂酶,芽胞桿菌α-淀粉酶和鏈霉菌膽固醇氧化酶。重組質?？梢杂行У剞D化5個不同種的雙歧桿菌。采用pMB1復制子分別與pLF5、pCLJ15、pSPEC1質粒構建了一系列以氯霉素抗性、紅霉素抗性及壯觀霉素抗性作選擇標記的穿梭載體。來源于pLF5質粒的衍生質粒pTRE3是最小的(2.8kb)雙歧桿菌載體,此載體具有1個方便的多克隆位點并具有結構和分離穩(wěn)定性。穿梭質粒是能在兩種或兩種以上宿主中復制的質粒,以大腸桿菌為宿主,有利于轉化和重組子的篩選,并能增加所需DNA克隆片段的檢出率,如果克隆載體也能在所研究菌株中復制,那么就可以檢驗所克隆片段在天然宿主中基因表達的作用。Missich等成功地構建了1個大腸桿菌—長雙歧桿菌的穿梭載體。將pMB1質粒經限制性酶切和連接酶作用,在體外與pGEM-5zf(+)質粒重組,形成pRM1重組質粒,pMB在體外連接上一個SPr基因而構成pRM2重組質粒,將該重組質粒分別轉化大腸桿菌和雙歧桿菌,均篩選到重組子,說明pRM2重組質粒為穿梭載體。但該穿梭載體轉化大腸桿菌與雙歧桿菌的效率不同,對雙歧桿菌轉化效率還有待于提高。大腸桿菌—雙歧桿菌穿梭載體的成功構建,將為今后雙歧桿菌遺傳分子機理的研究和基因工程菌的研制提供有力的工具。除在球雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)有與四環(huán)素抗性有關的質粒外,在雙歧桿菌中檢出的質粒多是隱性質粒。Mattareli等曾通過總蛋白質電泳分析來探討球雙歧桿菌質粒可能編碼的表型特征,但未