基因表達載體的構建

會計學1基因表達載體的構建第一節(jié)基因表達的概述和基本條件一、基因表達的基本概念二、基因表達的基本條件三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控第1頁/共49頁第二節(jié) 在大腸桿菌中影響外源基因表達的一、啟動子結(jié)構對因表達素效率的影響二、表達載體的選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用四、mRNA的一級結(jié)構與基因表達五、mRNA的二級結(jié)構對翻譯起始的影響六、mRNA穩(wěn)定性的影響七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對外源基因表達效率的影響八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達的關系九、宿主選擇對表達的影響十、培養(yǎng)條件的控制對表達效率的影響第2頁/共49頁一、基因表達的基本概念生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達是目的基因DNA在導入的細胞

內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和

mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等第3頁各/共49頁個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關鍵，原核的基因表達過程和方式與真二、基因表達的基本條件

1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯位及錯碼。否則會

導致編碼錯誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)

部應不含兩端酶切位點的識別序列。

2.插入的外源基因必須放在原核的啟動子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識別插入的基因。

3.外源基因必須能在大腸桿菌中進行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當穩(wěn)定，并

且能有效地進行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。第4頁/共49頁三、真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件㈡正確轉(zhuǎn)譯㈢原核表達載體的構建第5頁/共49頁㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件1.RNA聚合酶

2.啟動子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動（啟動子的概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用的終止4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用第6頁/共49頁㈡正確轉(zhuǎn)譯1.起始密碼子（intiqtion

codon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點（RBS，又稱SD序列）第7頁/共49頁㈢原核表達載體的構建原核表達載體的構建的要求1.表達載體類型2.表達載體的舉例3.包涵體表達載體第8頁/共49頁啟動子⑴乳糖啟動子（Lac）⑵Trp啟動子⑶Tac啟動子⑷噬菌體的PL和PR啟動子⑸脂蛋白啟動子（LPP）第9頁/共49頁啟動子結(jié)構對表達效率的影響

啟動子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17

bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動子效果好。第10頁/共49頁表達載體的選擇

載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達載體。第11頁/共49頁外源基因（cDNA）中密碼子的作用

細菌中基因表達對密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達效果

差，特別當有AGA-AGG連續(xù)序列存在時表達效率低第12頁/共49頁mRNA的一級結(jié)構與基因表達啟始密碼子：表達效率AUG>GUG>UUG

SD序列：較長的效率高，如

UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻譯區(qū)，若有5’-UGAUCU，則有增強作用。第13頁/共49頁mRNA的二級結(jié)構對翻譯起始的影響

mRNA形成二級結(jié)構時，可產(chǎn)生莖環(huán)。若

SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見表6-1第14頁/共49頁mRNA穩(wěn)定性的影響

REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護作用。第15頁/共49頁真核基因在原核細胞中表達及調(diào)控的特點1.2.3.4.5.6.7.只有一種RNA聚合酶以操縱子為單位來完成基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄無RNA剪接功能因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進行的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時合成多條肽鏈有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯的起始無糖基化功能第16頁/共49頁RNA聚合酶

原核細胞只有一種RNA聚合酶，當其核心酶與σ因子結(jié)合，形成全酶后，才能識別

DNA上的啟動子進行轉(zhuǎn)錄。第17頁/共49頁啟動子的概念

啟動子是位于結(jié)構基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與σ因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當啟動子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點開始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1。第18頁/共49頁轉(zhuǎn)錄作用的終止

由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止的有關的DNA的序列稱終止子。

強終止子：不依賴ρ因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對多，有四個以上U，致使

RNA聚合酶構象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10

弱終止子：依賴ρ因子發(fā)揮終止作用。如圖6-11第19頁/共49頁轉(zhuǎn)錄的弱化作用

轉(zhuǎn)錄的弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒有到達終止信號處而中途停止轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。第20頁/共49頁起始密碼子

起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達作用

AUG＞GUG。第21頁/共49頁核糖體結(jié)合位點

轉(zhuǎn)錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互補其互補程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果有關。如圖第22頁/共49頁表達載體類型1.2.3.4.表達載體的類型主要有四種：非融合型表達載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表達載體，如PINⅢ-ompA1如圖6-15融合蛋白型表達載體，如PGEX如圖6-16

包涵體型表達載體，如pBV220如圖6-17第23頁/共49頁原核表達載體的構建的要求完整的表達載體（質(zhì)粒）應有強啟動子（P）、終止子（T）、多個酶切位點、有

抗性標記、復制子和RBS的SD序列。（如

圖6-13）還應結(jié)合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白的表達形式和存放地點（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細胞。第24頁/共49頁乳糖啟動子（Lac）

無乳糖時，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進而

阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時，乳糖能與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構解離而行使轉(zhuǎn)錄功能。如圖6-2

而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖）誘導轉(zhuǎn)錄。Lac啟動子改建如圖6-3、6-4(a)(b)第25頁/共49頁Trp啟動子

色氨酸啟動子（

Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構激活而與啟動子結(jié)合，阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。無色氨酸時，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導劑，誘

發(fā)色氨酸啟動子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時，衰減子對Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）第26頁/共49頁Tac啟動子

Tac啟動子是由Trp啟動子和Lac啟動子構建

而成的雜合啟動子，-35區(qū)為Trp啟動子順序，-10為LacUV5啟動子順序，二者之間距離為

16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動子只需用IPTG誘導轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-7第27頁/共49頁噬菌體的PL和PR啟動子

PL為λφ左向啟動區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR

轉(zhuǎn)錄，

但CI在42℃誘導轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）。第28頁/共49頁脂蛋白啟動子（LPP）

脂蛋白為細胞外膜蛋白，細菌中含量高，該啟動子表達效率高，由信號肽可將基因表達產(chǎn)物分泌到胞外，常用來構造分泌型表達載體。第29頁/共49頁第30頁/共49頁第31頁/共49頁第32頁/共49頁第33頁/共49頁第34頁/共49頁第35頁/共49頁第36頁/共49頁第37頁/共49頁第38頁/共4