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實驗二質(zhì)粒的酶切和瓊脂糖凝

膠電泳檢測實驗二質(zhì)粒的酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測實驗目的實驗原理實驗儀器、材料與試劑實驗步驟實驗結果及討論

一、實驗目的

限制性內(nèi)切酶切割出目的DNA了解瓊脂糖凝膠電泳的原理掌握瓊脂糖凝膠的制作及進行電泳的方法

二、實驗原理

利用限制性內(nèi)切酶具有特定的識別及切割位點，定點切割環(huán)狀質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中常規(guī)的實驗方法，它能檢測少量的DNA（如用肉眼觀察，可檢測到10ng的DNA），且檢測的范圍很廣。瓊脂糖凝膠電泳對DNA分子的檢測，主要基于在凝膠中加入溴化乙錠，這樣溴化乙錠分子就會嵌入DNA分子中形成絡合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強的熒光，而在紫外光下DNA發(fā)出的熒光是可見光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強度正比于DNA的含量，因而DNA的檢測很方便。如將已知大小和濃度的標準樣品（Marker）作電泳對照，就可估計出待測樣品的大小和濃度。三、實驗儀器、材料與試劑

儀器1.水平式凝膠電泳槽2.穩(wěn)壓電泳儀3.電爐4.紫外檢測儀5.臺式離心機材料實驗一中提取的質(zhì)粒DNA和本實驗酶切后的質(zhì)粒DNA。試劑1.限制性內(nèi)切酶EcoRI，HindIII(XholI)2.50×TAE電泳緩沖液（pH8.0）:Tris242g冰醋酸57.1ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）100ml稀釋到電泳緩沖液1×TAE

3.溴化乙錠溶液:10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑紙包裝保存。4.10×(6×)

×DNA樣品上樣緩沖液(LoadingBuffer,溴酚藍指示劑,DNA樣品加樣緩沖液)5.瓊脂糖Agarose四、實驗步驟在20μL反應體系中，包括：質(zhì)粒KS16

μLEcoRI1μLXholI1

μLBufferH2μLddH2O0μL

37℃酶切1.5~2.0

小時。

或在20μL反應體系中，包括：質(zhì)粒pMD18-T16μLEcoRI1μLHindIII

1

μLBufferM2μLddH2O0μL

37℃酶切1.5~2.0

小時。

注：雙酶切體系。最初我們PCR使用的PMD18-T(KS)載體特點：600bp外源基因片段的兩端分別被EcoRI和HindIII(XhoI)

酶切，插入PMD18-T(KS)載體MCS多克隆位點，因而可進行EcoRI和HindIII(XhoI)雙酶切驗證。雙酶切得到的小的外源片段大小應是600bp左右。

pMD18-TVector

pBCSKmap瓊脂糖凝膠制備步驟1.洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干；2.插好擋板、梳子；3.配制1%的Agrose瓊脂

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