兩融合法篩選斑玉蘚中漆酶的研究

兩融合法篩選斑玉蘚中漆酶的研究

蘑菇h.e.黑玉也被稱為蘑菇。日本稱為真菌屬agal，屬于傘菌屬，屬于蘑菇科ticholomatace，hypsizagus。這是一種稀有而珍貴的食品。在栽培生產(chǎn)中其生產(chǎn)周期較長(zhǎng)(胡開輝等2009),菌體的生長(zhǎng)速度較慢,抑制雜菌的能力較差,在一定程度上限制了真姬菇的推廣生產(chǎn)(胡開輝和出小平2008)。漆酶最早發(fā)現(xiàn)于漆樹,是一種含銅的酚氧化酶(Leatham&Slahanman1981)在菌體的生長(zhǎng)過(guò)程中參與木質(zhì)素的降解,可為菌體生長(zhǎng)提供養(yǎng)料,在降解木質(zhì)素的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生酚類和醌類等抑制雜菌生長(zhǎng)的化合物,可有效地抵抗雜菌的污染(Zhao&Kwan1999)。漆酶活性的高低可能與菌體的生長(zhǎng)速度,生產(chǎn)周期有密切的關(guān)系,漆酶活性較高的菌種生長(zhǎng)速度較快,生產(chǎn)周期相對(duì)較短(朱海瀟2008)。食用菌育種研究已成為食用菌科技工作者關(guān)注的熱點(diǎn)之一(馬三梅等2004)。目前食用菌育種的主要目標(biāo)是提高食用菌的品質(zhì)和產(chǎn)量,而縮短生產(chǎn)周期和提高產(chǎn)量相結(jié)合的研究?jī)H局限于栽培條件的改善,未能從根本上解決有些食用菌生產(chǎn)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。食用菌主要育種方法有馴化育種、孢子分離育種、雜交育種、誘變育種及基因工程育種等(宋冬靈等2007),但每種方法都缺乏有效的篩選標(biāo)記,造成選育新品種費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、工作量大、周期長(zhǎng)等問(wèn)題(陳娟和蘇開美2008)。漆酶具有降解木質(zhì)素,氧化降解酚類物質(zhì),抑制雜菌,改善出菇品質(zhì)等重要作用(周光龍和余大廷1992),但漆酶在食用菌育種中的研究未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道,本研究采用漆酶轉(zhuǎn)化與原生質(zhì)體融合相結(jié)合的技術(shù),建立斑玉蕈育種中漆酶轉(zhuǎn)化體系,將漆酶活性較高、生長(zhǎng)速度較快、抗菌能力較強(qiáng)的鳳尾菇(朱海瀟等2008)原生質(zhì)體滅活與具有活性的斑玉蕈原生質(zhì)體融合,采用RB-PDA平板顯色法篩選具有漆酶活性的融合菌株,并對(duì)其相關(guān)特性做了初步研究。該方法的建立對(duì)今后斑玉蕈育種及品質(zhì)改良提供了一種新思路,對(duì)其他食用菌育種也具有一定的借鑒作用。1材料和方法1.1菌種igig、鳳尾菇、pleurol-saravi斑玉蕈(真姬菇9600Hypsizigusmarmoreus)、鳳尾菇Pleurotussajor-caju為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,蔗糖2%,瓊脂2%,pH自然。液體培養(yǎng)基:發(fā)干酵母粉0.5%,蛋白胨0.05%,蔗糖2%,磷酸二氫鉀0.05%,硫酸鎂0.05%。再生培養(yǎng)基:蔗糖0.4mol/L,發(fā)干酵母粉0.5%,蛋白胨0.05%,瓊脂下層用2%,上層用0.3%(彭衛(wèi)紅等2005)。RB-PDA亮藍(lán)培養(yǎng)基:馬鈴薯20%,蔗糖2%,瓊脂2%,pH自然,121℃高壓滅菌20min備用。冷卻至60℃左右時(shí)加入已滅菌的5mg/mL的RB亮藍(lán)溶液適量,使培養(yǎng)基中RB亮藍(lán)濃度為0.05%(W/V),混合均勻,傾倒平板(黃乾明2006)。1.3pcr反應(yīng)溶壁酶液:溶壁酶(Lywallzyme)購(gòu)于Sigma公司,用0.6mol/LMgSO4配制成2%(W/V)濃度的酶液,用0.22μm的濾膜除菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ诤蟿?25%(W/V)聚乙二醇(PEG)4000,CaCl2·H2O50mmol/L,甘露醇0.6mol/L,pH8.0。穩(wěn)滲劑:0.6mol/L甘露醇。RB亮藍(lán)溶液:RB亮藍(lán)(RemazolbrilliantblueR)購(gòu)于Sigma公司。稱取適量RB亮藍(lán)粉末配制成5mg/mL的溶液,121℃滅菌20min,備用。PCR反應(yīng)所用的TaqDNAPolymerase,dNTPMixture,10×PCRBuffer,DNAMarker(DL2000)購(gòu)自TaKaRa(大連)有限公司。引物均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。1.4生長(zhǎng)曲線法檢測(cè)采用RB-PDA平板顯色法檢測(cè)漆酶活性,將鳳尾菇和斑玉蕈分別由試管斜面轉(zhuǎn)接到RB-PDA亮藍(lán)培養(yǎng)基的平板中,25℃恒溫培養(yǎng),進(jìn)行顯色觀察。1.5兩種菇的酶解將斑玉蕈與鳳尾菇分別由試管斜面轉(zhuǎn)接至裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中25℃靜置培養(yǎng)5-7d,在無(wú)菌的條件下切取菌塊邊緣幼嫩的菌絲并用無(wú)菌水洗滌3-5遍,用吸水紙吸去多余的水分然后稱取200mg,將制備好的兩種菇的菌絲體分別移入離心管中加入3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%溶壁酶液在30℃水浴中酶解2.5-3.0h,每10min輕搖一次。經(jīng)酶解處理而得的原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑洗滌2-3遍,然后離心去除穩(wěn)滲劑和酶液,在光學(xué)顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的形狀,并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1.6斑玉蚤原生質(zhì)體的復(fù)配取1mL制備好的鳳尾菇原生質(zhì)體于55℃水浴滅活處理45-50min,然后加入1mL具有活性的斑玉蕈原生質(zhì)體和2mL融合劑于32℃水浴溫育25-30min,離心去除融合劑,適當(dāng)稀釋至40倍光學(xué)顯微鏡下視野中3-5個(gè)原生質(zhì)體為宜。然后分別吸取滅活的鳳尾菇原生質(zhì)體、具有活性的斑玉蕈原生質(zhì)體及融合后的原生質(zhì)體100μL在含有再生培養(yǎng)基的平板上涂布,于25℃恒溫培養(yǎng)。1.7綜合菌株篩選采用原生質(zhì)體滅活和RB-PDA平板顯色相結(jié)合的方法篩選融合菌株。1.8綜合消毒1.8.1斑玉蚤、鳳尾菇抗逆性測(cè)定采用兩點(diǎn)接種法分別將融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A與斑玉蕈、鳳尾菇接在同一含有PDA培養(yǎng)基的平板內(nèi),于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃恒溫培養(yǎng),觀察記錄各菌株間的拮抗?fàn)顩r。1.8.2pcr擴(kuò)增程序采用CTAB法,分別提取斑玉蕈、鳳尾菇及融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A的基因組DNA,進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳。25μLRAPD反應(yīng)體系中含DNA模板1μL(30ng/μL)、10×PCRbuffer2.5μL、dNTP2μL(2.5mmol/L)、primer2μL(5μmol/L)、TaqDNA聚合酶0.2μL(5U/μL),加ddH2O到25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,36℃復(fù)性2min,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1μLLoadingbuffer混勻上樣,在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,以0.5倍TBE為電泳緩沖液,110V電壓下電泳1h,最后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照并存盤。1.8.3pcr擴(kuò)增檢索漆酶基因,據(jù)檢索到的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物、進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳分析,檢測(cè)融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A基因組中是否已轉(zhuǎn)入漆酶基因。漆酶基因PCR擴(kuò)增的體系:25μL反應(yīng)體系中含DNA模板1μL(30ng/μL)、10×PCRbuffer2.5μL、dNTP2μL(2.5mmol/L)、引物(LA:5′-GTCATGTTTCCAGGCGCACGG-3′;LB:5′-GGCCAGGCCTTAGGACGGAACGATG-3′)各2μL(5μmol/L)、TaqDNA聚合酶0.2μL(5U/μL),加ddH2O到25μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序94℃預(yù)變性5min;然后94℃變性1min,55℃復(fù)性45s,72℃延伸45s,40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1μLLoadingbuffer混勻后上樣,在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,以0.5倍TBE為電泳緩沖液,110V電壓下電泳1h,最后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照并存盤,回收鳳尾菇和融合菌株相同的特異條帶并測(cè)序。1.9不同漆酶活性對(duì)酶活性的影響融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A三次試管傳代后采用RB-PDA平板法測(cè)定其漆酶活性。為進(jìn)一步檢驗(yàn)融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A的遺傳穩(wěn)定性,對(duì)其進(jìn)行了出菇試驗(yàn),然后采用組織分離法獲得純培養(yǎng)菌種檢測(cè)其漆酶活性,并提取其基因組DNA進(jìn)行漆酶基因的PCR擴(kuò)增。2結(jié)果與分析2.1a平板添加量的確定RB亮藍(lán)是漆酶的一種底物,在漆酶的作用下顏色會(huì)由藍(lán)色變?yōu)槌帱S色。鳳尾菇能使RB-PDA平板由藍(lán)色變成赤黃色(圖1),接種后2-3d接種塊周圍開始變色,變色圈直徑大小與菌絲直徑基本一致,說(shuō)明鳳尾菇漆酶活性較高。而斑玉蕈不能使RB-PDA平板變色,培養(yǎng)20d左右,菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板后RB-PDA平板仍為藍(lán)色沒(méi)有發(fā)生變化,說(shuō)明斑玉蕈不具有漆酶活性。2.2原生質(zhì)體的測(cè)定取制備好的鳳尾菇和斑玉蕈的原生質(zhì)體在光學(xué)顯微鏡下觀察,原生質(zhì)體多成球狀或近似球狀,用血球計(jì)數(shù)板測(cè)得鳳尾菇原生質(zhì)體數(shù)為3.25×105個(gè)/mL,斑玉蕈原生質(zhì)體數(shù)為1.32×104個(gè)/mL,達(dá)到了融合所需要的濃度。2.3原生質(zhì)體的再生反應(yīng)熱滅活的鳳尾菇原生質(zhì)體和斑玉蕈原生質(zhì)體各涂布10個(gè)平板,均沒(méi)有形成菌落,說(shuō)明滅活比較徹底,而沒(méi)有滅活的鳳尾菇和斑玉蕈原生質(zhì)體在含有再生培養(yǎng)基的平板上形成了新的菌落,說(shuō)明制備的原生質(zhì)體具有再生的能力,每個(gè)平板涂布10-15個(gè)原生質(zhì)體,斑玉蕈原生質(zhì)體再生形成菌落生長(zhǎng)的速度比鳳尾菇慢(圖2)。兩菌種間菌落生長(zhǎng)速度的差異和菌絲形態(tài)的差別,也可作為融合菌株篩選的參考依據(jù)。2.4漆酶基因型檢測(cè)采用RB-PDA平板顯色法篩選具有漆酶活性的融合菌株,將生長(zhǎng)速度較快的單菌落融合菌株轉(zhuǎn)接到RB-PDA平板上進(jìn)行顯色觀察。融合菌株能使平板由藍(lán)色變?yōu)槌帱S色,說(shuō)明漆酶基因已從鳳尾菇基因組中轉(zhuǎn)入斑玉蕈的基因組中并成功表達(dá)、分泌到培養(yǎng)基中作用于RB-PDA平板,使顏色發(fā)生變化(圖3-A、C)。試驗(yàn)結(jié)果還表明變色明顯的菌株菌絲較純白、濃密、活力較強(qiáng)、生長(zhǎng)速度較快,與親本斑玉蕈相比具有一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖3-B、D)。不同融合菌株的顯色時(shí)間及顯色能力有較大的差異,通過(guò)對(duì)5次融合試驗(yàn)所得的融合菌株進(jìn)行篩選比較,選出變色能力較強(qiáng)、生長(zhǎng)速度較快的融合菌株Ⅲ18C,Ⅲ2A。2.5菇兩親本間的抗逆性融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A與斑玉蕈和鳳尾菇兩親本的拮抗現(xiàn)象明顯,每?jī)蓚€(gè)菌株間均有拮抗線,而且兩個(gè)融合菌株間也有拮抗線,說(shuō)明這兩個(gè)融合菌株并非同一菌種(圖4)。2.6引物篩選及其擴(kuò)增效果的表現(xiàn)從引物S10,S22,S23,S62,S1010,S2047中篩選擴(kuò)增條帶清晰,多態(tài)性豐富和重現(xiàn)性好的引物S1010,S22,S62,對(duì)鳳尾菇、斑玉蕈及兩融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。3種引物所擴(kuò)增的供試菌株的DNA片段數(shù)量及其分子量大小都有顯著差別(圖5),說(shuō)明篩選的引物能正確地反映各菌株間的遺傳差異。引物S1010、S22擴(kuò)增結(jié)果表明,Ⅲ18C、Ⅲ2A與斑玉蕈的遺傳差異較小(擴(kuò)增出的DNA片段數(shù)目及對(duì)應(yīng)片段分子量大小基本一致),與鳳尾菇的遺傳差異較大(擴(kuò)增的DNA片段數(shù)目尤其是片段分子量差異明顯)。而引物S62擴(kuò)增結(jié)果顯示,Ⅲ18C、Ⅲ2A不僅與鳳尾菇的遺傳差異較大而且與斑玉蕈也有顯著的遺傳差異(擴(kuò)增的DNA片段數(shù)目明顯多于兩親本而且出現(xiàn)了新的片段),說(shuō)明兩融合菌株的基因組已與兩親本不同,同時(shí)也證明了采用RB-PDA平板顯色技術(shù)可以準(zhǔn)確有效地篩選融合菌株。2.7dna模板的制備斑玉蕈沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,鳳尾菇及兩融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A均擴(kuò)增出了條帶(圖6),陰性對(duì)照PCR體系中DNA模板用無(wú)菌蒸餾水代替。測(cè)序結(jié)果表明,片段長(zhǎng)455bp,與Pleurotusostreatus相似性達(dá)60%,試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明利用原生質(zhì)體融合技術(shù)在鳳尾菇和斑玉蕈間成功地實(shí)現(xiàn)了漆酶基因的轉(zhuǎn)化,所篩選到的兩融合菌株是具有漆酶基因的斑玉蕈新菌株,同時(shí)這也與本研究前期對(duì)鳳尾菇和斑玉蕈漆酶活性測(cè)定的結(jié)果一致。2.8c、2純培養(yǎng)菌株對(duì)rb-pda平板變色的pcr檢測(cè)融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A經(jīng)3次傳代后仍能使RB-PDA平板變色,說(shuō)明具有漆酶活性,試驗(yàn)結(jié)果與初篩一致。組織分離法獲得的融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A純培養(yǎng)菌種能使RB-PDA平板變色(圖7),漆酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果與初次擴(kuò)增結(jié)果一致。說(shuō)明本研究采用RB-PDA平板顯色法篩選具有漆酶活性的融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A具有良好的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)室出菇試驗(yàn)結(jié)果顯示,融合菌株Ⅲ18C、Ⅲ2A的生物學(xué)效率明顯高于親本斑玉蕈而生產(chǎn)周期與斑玉蕈相比有一定的縮短。關(guān)于融合菌株的生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能還有待于做進(jìn)一步的深入研究。3結(jié)論和討論3.1原生質(zhì)體的融合菌株的篩選目前融合菌株的篩選多采用抗藥性標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、形態(tài)差異觀察(鄒莉等2006)、鎖狀聯(lián)合(孫麗等1999)、次生代謝產(chǎn)物抗性(陳家任等1998)、熒光色素標(biāo)記(熊杰等2006)及滅活原生質(zhì)體(王澄澈和梁枝榮2000)等方法。每種篩選方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn),但這些原生質(zhì)體融合菌株的篩選方法只能確定融合菌株具有活性,關(guān)于融合菌株的遺傳信息及是否具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值,最終只能通過(guò)出菇試驗(yàn)來(lái)證明,操作起來(lái)比較繁瑣,工作量大,親本的優(yōu)良性狀易受到影響甚至丟失(曾榮等1995)。本研究根據(jù)出發(fā)菌株鳳尾菇與斑玉蕈漆酶活性的差異,建立不同菌株間的漆酶轉(zhuǎn)化體系,采用RB-PDA平板顯色技術(shù)與原生質(zhì)體滅活相結(jié)合的方法能快速、高效地篩選出具有漆酶活性的融合菌株,目標(biāo)明確、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、一目了然。此種篩選方法相對(duì)于傳統(tǒng)篩選方法具有顯著優(yōu)越性,在食用菌育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。3.2其他方面的研究漆酶具有廣泛的作用底物,可以氧化降解酚類化合物及其衍生物(Yaropolovetal.1994),也可以氧化降解一些不含酚羥基的酚類類似物及木質(zhì)素(Bourbonnais&Paice1990),對(duì)漆酶應(yīng)用的研究多見(jiàn)于改善油漆的性能,處理含有酚類物質(zhì)的污水,改進(jìn)造紙工藝,進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè),酶法合成化合物等(Thurston1994)。關(guān)于漆酶在食用菌栽培生產(chǎn)中的研究報(bào)道極少,Zhao&Kwan(1999)報(bào)道了漆