響應(yīng)面法優(yōu)化玉米加工過程中脂肪酶活力的研究

響應(yīng)面法優(yōu)化玉米加工過程中脂肪酶活力的研究

金秀福是中國(guó)傳統(tǒng)服裝的典型代表。它已有900多年的歷史。它的獨(dú)特口感和品質(zhì)深受中國(guó)和東南亞消費(fèi)者的歡迎，在世界傳統(tǒng)服裝生產(chǎn)中也占有重要地位。但相關(guān)研究,尤其是對(duì)風(fēng)味形成機(jī)理的研究較少,對(duì)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的科學(xué)內(nèi)涵認(rèn)識(shí)不足。目前金華火腿仍停留在傳統(tǒng)手工作坊生產(chǎn)方式上。研究金華火腿生產(chǎn)過程中內(nèi)源酶的作用,科學(xué)認(rèn)識(shí)風(fēng)味形成機(jī)理,對(duì)實(shí)現(xiàn)金華火腿的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。近年來,歐洲對(duì)干腌火腿風(fēng)味形成機(jī)理進(jìn)行了廣泛研究。眾多研究結(jié)果顯示,干腌火腿的風(fēng)味主要來自于酶促反應(yīng)和相關(guān)的生化變化,如蛋白質(zhì)水解和Strecker降解、脂肪降解及氧化、美拉德反應(yīng)等。其中內(nèi)源酶作用導(dǎo)致的蛋白質(zhì)和脂肪的變化對(duì)風(fēng)味前體物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用,脂類物質(zhì)則被認(rèn)為是主要的干腌火腿風(fēng)味前體物質(zhì),直鏈的醛、烷烯烴、酮、醇及呋喃類風(fēng)味成分被認(rèn)為主要來自于脂類物質(zhì)的變化,金華火腿中約46%的風(fēng)味物質(zhì)直接來自于脂肪。在干腌火腿加工過程中,脂類物質(zhì)首先在脂肪酶作用下發(fā)生水解,使游離脂肪酸積累,游離脂肪酸的積累使脂類物質(zhì)更易發(fā)生氧化生成風(fēng)味成分。任何影響脂肪酶作用的因素都會(huì)對(duì)干腌火腿生產(chǎn)過程中脂類物質(zhì)的變化產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響火腿風(fēng)味的產(chǎn)生[18,19,20,21,22,23]。已有研究者對(duì)歐洲著名干腌火腿生產(chǎn)過程脂肪酶活力的變化進(jìn)行了相關(guān)研究,郇延軍等研究了金華火腿生產(chǎn)過程中磷脂酶活力的變化。但尚未見有關(guān)金華火腿生產(chǎn)過程中脂肪酶活力變化的報(bào)道。另外,以往研究主要集中在生產(chǎn)過程中脂肪酶潛在活力(酶適宜生化條件下的活力)的變化和活力殘留,未對(duì)具體生產(chǎn)條件下酶的真實(shí)活力進(jìn)行研究。因不斷變化的生產(chǎn)條件完全不同于酶的最適條件,生產(chǎn)過程中酶的潛在活力和實(shí)際表現(xiàn)活力有很大不同,用潛在活力難以有效客觀地評(píng)價(jià)生產(chǎn)過程中酶的作用。筆者跟蹤研究了金華火腿傳統(tǒng)工藝條件下脂肪酶的變化情況,利用響應(yīng)曲面法對(duì)生產(chǎn)過程中酶所表現(xiàn)出的真實(shí)水解能力(真實(shí)活力)進(jìn)行了預(yù)測(cè),以期更好地評(píng)價(jià)脂肪酶在風(fēng)味形成中的作用,為金華火腿傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供理論指導(dǎo)。1材料和方法1.1原料加工和流通60條重6.2～6.9kg的兩頭烏雜交豬(5～6月齡,90～100kg)后腿為原料,按傳統(tǒng)工藝在浙江省食品公司金鑫火腿廠加工。其簡(jiǎn)要生產(chǎn)工藝過程是:原料→修坯→攤涼→腌制→洗腿→曬腿→發(fā)酵成熟→后熟→成品分別于主要工藝段隨機(jī)取5只腿的股二頭肌為樣品,樣品取出后真空封口,立即于-25℃下凍藏,取樣工藝點(diǎn)和生產(chǎn)天數(shù)如表1所示。1.2實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑NaCI含量:ISO1841—1:1996;硝酸鹽含量:ISO3091—1975;亞硝酸鹽含量:ISO2918-1975;pH值:ISO2917:1999,用HI92240pH計(jì)(NANNAinstruments,Portugal)。所用化學(xué)試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)處理利用SPSS11.0進(jìn)行。生產(chǎn)過程中每日早中晚3次記錄環(huán)境溫度和濕度的變化。1.3酶活性分析采用Vestergaard等的方法,稍做改動(dòng)。1.3.1hcl緩沖液緩沖液緩沖液配制5g樣品(酸性脂肪酶測(cè)定時(shí)用6g)除卻可見脂肪和結(jié)締組織,迅速剪碎,加入50mL濃度為0.1mmol/L、pH值為7.0的Tris/HCl緩沖液。緩沖液中含有0.2%(w/w)TritonX-100、0.1μg/mL的抑肽素(pepstatin,Sigma)和1μg/mL的leupeptin-hemisulphate(Sigma),在冰水浴中用高速均漿機(jī)(XHF2I,上海金達(dá))于25000r/min均漿4×10s,然后在冰水浴中勻速攪拌30min,之后于4℃、10000g離心20min,上層液用玻璃纖維過濾,濾液用作酶活力測(cè)定。1.3.2熒光度的測(cè)定酸性脂肪酶活力測(cè)定:0.1mL酶提取液加入到2.8mLpH為5.0的0.103mol/LNa2HPO4/0.049mol/L檸檬酸緩沖液(含0.05%TritonX-100和0.8mg/mL牛血清白蛋白,BSA)中,之后加入0.1mL濃度為1.0mmol/L的四甲基形酮油酸酯(4-methylumbelliferyl-oleate,Sigma)作底物,迅速混勻后于37℃保溫30min,加入0.5mL1mol/L的HCl溶液終止反應(yīng),用熒光光度計(jì)(日立850,日本)于λex=328nm、λem=470nm測(cè)熒光度。中性脂肪酶活力測(cè)定:取0.1mL酶提取液加入到2.8mLpH為7.5的0.22mol/LTris/HCl緩沖液(含0.05%的TritonX—100)中,之后加入0.1mL濃度為1.0mmol/L的四甲基形酮油酸酯(4-methylumbelliferyl-oleate,Sigma)作底物,迅速混勻后于37℃保溫30min,迅速用冰水浴冷卻,并在1min內(nèi)于λex=328nm、λem=443nm測(cè)定熒光度。綜合酶活力測(cè)定:取0.1mL酶提取液加入到2.8mLpH為5.8的0.1mol/L磷酸緩沖液(含0.05%TritonX-100和0.8mg/mL牛血清白蛋白,BSA)中。其他測(cè)定事項(xiàng)同酸性脂肪酶活力測(cè)定。測(cè)定酶活力時(shí),空白樣用同體積的提取酶所用緩沖液代替酶提取液。用測(cè)定酶活的緩沖液配制系列濃度的4-甲基形酮(4-methylumbelliferone,Sigma)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,定義1g酶蛋白在1h內(nèi)產(chǎn)1nmol的4-甲基形酮為1個(gè)酶活力單位(U)。酶提取液蛋白含量測(cè)定采用雙縮脲法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)處理利用SPSS11.0進(jìn)行。1.4脂肪酶活力測(cè)定響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)的因素水平如表2所示。用Design-Expert6.0軟件(Stat-EaseInc.Minneapolis,USA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共計(jì)29組實(shí)驗(yàn),以鮮腿做樣品按2.3.1方法提取酶液,用pH為5.8、濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖液(含0.05%TritonX-100和0.8mg/mL牛血清白蛋白BSA)作為酶活測(cè)定緩沖液,該緩沖液在使用前按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)整食鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量,測(cè)定酶活時(shí)保溫溫度按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,其他事項(xiàng)同酸性脂肪酶活力測(cè)定。2結(jié)果與分析2.1脂肪酶的變化生產(chǎn)過程中酶活力及主要影響指標(biāo)的變化情況如表3所示。結(jié)果表明,火腿股二頭肌的pH變化很小,鮮腿的pH最低為5.61,成熟結(jié)束后pH達(dá)到最高為5.87。鹽含量隨生產(chǎn)的進(jìn)行逐漸增高,產(chǎn)品中的鹽含量高達(dá)9.5%。硝酸鹽和亞硝酸鹽含量在生產(chǎn)過程中的變化波動(dòng)很大,并且都具有較大的標(biāo)準(zhǔn)差,說明火腿中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量具有較大的個(gè)體差異。這與目前的手工上鹽操作(包括硝酸鹽與鹽混合的均勻性)有關(guān)。溫度及濕度的變化主要與季節(jié)有關(guān),生產(chǎn)過程中最高溫度記錄為42.3℃,出現(xiàn)在成熟中期到成熟結(jié)束工藝段。最低溫度為一3.0℃,出現(xiàn)在腌制工藝段。隨生產(chǎn)的進(jìn)行,酸性脂肪酶活力不斷下降,在成熟中期以前的各工藝點(diǎn),酶活力下降的程度十分顯著(P<0.05),之后下降不明顯(P>0.05)。中性脂肪酶的變化與酸性脂肪酶相似,酶活在成熟結(jié)束以前各工藝點(diǎn)下降十分顯著(P<0.05),之后下降不明顯(P>0.0.5)。酸性脂肪酶和中性脂肪酶活力均在后熟一1達(dá)到最小值,此時(shí)的酸性脂肪酶和中性脂肪酶活力分別是鮮腿酶活的8.16%和3.0%,在后熟一2工藝點(diǎn)2種酶均測(cè)不到的酶活。酶的綜合活力表現(xiàn)了在pH5.8時(shí),酸性脂肪酶和中性脂肪酶的綜合脂解能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,酶綜合活力隨生產(chǎn)過程的變化規(guī)律與酸性和中性脂肪酶相似,但在每一個(gè)工藝點(diǎn),酶綜合活力均低于中性和酸性脂肪酶的活力。2.2回歸模型的建立及顯著性檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中,溫度水平的確定依據(jù)生產(chǎn)過程記錄;硝酸鹽和鹽含量水平的確定依據(jù)實(shí)測(cè)結(jié)果;亞硝酸鹽含量水平的確定依據(jù)生產(chǎn)實(shí)測(cè)值并結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB2731-1988)。因生產(chǎn)過程pH變化很小,只有0.26,故未將pH作為考察因子,響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)中酶活力在pH5.8(生產(chǎn)過程中股二頭肌pH變化的平均值)的條件下進(jìn)行。如上所述,該pH條件下的酶活是酸性脂肪酶和中性脂肪酶的綜合活力,反應(yīng)了生產(chǎn)過程中股二頭肌酸性和中性脂肪酶的綜合脂解能力。通過對(duì)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸分析得出了酶活力自然對(duì)數(shù)的最優(yōu)數(shù)學(xué)模型(式1)。該模型的方差分析如表4所示。從分析結(jié)果可以看出,生產(chǎn)過程中溫度、鹽含量是酶活力的顯著影響因子,其一次項(xiàng)和二次項(xiàng)(P<0.01)以及二者之間的交互項(xiàng)(P<0.05)均對(duì)酶活產(chǎn)生顯著影響。硝酸鹽和亞硝酸鹽含量分別在0～50mg/kg和0～20mg/kg的范圍內(nèi)時(shí),不對(duì)脂肪酶的活力產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。式中:Ln(lipase):脂肪酶活的自然對(duì)數(shù)值;B:溫度(℃);C:鹽含量(%)?；貧w診斷分析表明,數(shù)學(xué)模型的R2、校正R2和預(yù)測(cè)R2均達(dá)到較高水平,模型的信噪比為31.09,遠(yuǎn)高于臨界數(shù)值4。說明了回歸方程的可靠和有效性。溫度和鹽含量影響酶活力的響應(yīng)曲面如圖1所示。4～45℃,酶活力隨溫度的升高逐步升高,但在35℃之后,酶活隨溫度上升的趨勢(shì)明顯趨緩;溫度對(duì)酶活力影響的程度與鹽含量有關(guān),隨著鹽含量增大,溫度對(duì)酶活力的影響增強(qiáng)。鹽含量對(duì)酶活力的影響比較復(fù)雜,當(dāng)鹽含量低于某一臨界值時(shí),表現(xiàn)出對(duì)酶活的促進(jìn)作用;當(dāng)高于某一臨界值時(shí),則表現(xiàn)出對(duì)酶活的抑制用。鹽含量的這一臨界值與溫度相關(guān),隨溫度升高,鹽含量的臨界值增大,4℃時(shí),臨界值約為4.5%,45℃時(shí),臨界值約為9.5%。2.3不同工藝點(diǎn)的綜合酶活力變化利用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)所得回歸方程(式1)及生產(chǎn)過程的綜合酶活殘留(見表3),可預(yù)測(cè)生產(chǎn)過程的實(shí)際綜合酶活(式2),預(yù)測(cè)的生產(chǎn)過程脂肪酶實(shí)際綜合活力的變化情況如表5所示。A:利用回歸模型(式1)計(jì)算出的酶活d:生產(chǎn)過程中綜合酶活殘留(見表3)表5所反映的預(yù)測(cè)的綜合酶活力的變化情況與酸性脂肪酶、中性脂肪酶及pH5.8時(shí)的綜合酶活力變化情況完全不同。在曬后工藝點(diǎn)之前,實(shí)際綜合酶活力的變化較小,但每個(gè)工藝點(diǎn)的酶活均低于酸、中性脂肪酶活及pH5.8時(shí)的綜合酶活。成熟中期實(shí)際綜合酶活達(dá)到最低點(diǎn),之后有所回升,且在成熟結(jié)束和后熟一1工藝點(diǎn),實(shí)際綜合酶活高于酸性、中性和pH5.8時(shí)的綜合酶活。4ph和nacl對(duì)脂肪酶活力的影響目前,尚未見有關(guān)金華火腿加工過程中脂肪酶活力變化的報(bào)道。研究中,鮮腿酸性脂肪酶和中性脂肪酶的活力分別為1.96和5.33U,該結(jié)果與Vestergaard等的研究結(jié)果具有一定的可比性。Vestergaard等在研究意大利珀?duì)柆敾鹜葧r(shí),用質(zhì)量為8～10kg的豬后腿為原料,其鮮腿中酸性和中性脂肪酶的活力分別是1.52和0.33U,其酶活力單位表述與本實(shí)驗(yàn)相同。Toldrá等在研究輕豬腿和重豬腿中脂肪酶活力時(shí)指出,輕腿中酸性脂肪酶和中性脂肪酶活力分別為0.18和0.37U,重腿中的酶活分別是0.17和0.31U;Flores等指出,宰齡為6個(gè)月大的雄性雜交豬(Pietrain×Landrace),其背最長(zhǎng)肌、半膜肌和股二頭肌中酸性脂肪酶活力分別為0.33、0.40和0.39U,在上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)中,一個(gè)酶活力單位表述為1g酶蛋白1h水解1μmol的底物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能來自于不同的實(shí)驗(yàn)方法、樣品和豬的屠宰年齡。隨著豬齡的增大,中性脂肪酶的活力減小而酸性脂肪酶的活力增大。隨著金華火腿加工過程的進(jìn)行,中性和酸性脂肪酶活力均呈下降趨勢(shì),筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Vestergaard等的研究結(jié)果有相似之處。研究中,金華火腿加工過程中脂肪酶活力的下降可能來自于酶蛋白的變性和降解。隨著加工過程的進(jìn)行,鹽的含量不斷增高,鹽濃度的增大帶來了細(xì)胞質(zhì)的濃縮效應(yīng),會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性;另外生產(chǎn)過程中的物理和化學(xué)因素會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的破壞,使溶酶體蛋白酶釋放從而導(dǎo)致脂肪酶降解而使活力下降。金華火腿生產(chǎn)過程中,pH變化很小,均值為5.8,在該pH條件下酸性脂肪酶和中性脂肪酶均能產(chǎn)生脂解作用。測(cè)pH5.8時(shí)脂肪酶的綜合酶活力就是為了了解在生產(chǎn)過程pH條件下酸性脂肪酶和中性脂肪酶綜合的脂解能力,以便于更具體分析脂類物質(zhì)在加工過程中的變化。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,pH5.8時(shí)脂肪酶的綜合酶活力均低于酸性脂肪酶和中性脂肪酶的活力,說明在偏離最適pH條件下酸性和中性脂肪酶的潛在活力均未得到很好表現(xiàn)。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),pH5.8時(shí)脂肪酶的綜合酶活與酸性和中性脂肪酶活力之間的R2分別為0.99和0.97,這在一定程度上說明生產(chǎn)過程中酸性脂肪酶在脂肪水解中起到了更多的作用。目前尚未見到利用響應(yīng)曲面法研究干腌火腿生產(chǎn)過程中脂肪酶實(shí)際活力變化的報(bào)道。相關(guān)的利用響應(yīng)曲面分析脂肪酶的研究認(rèn)為,脂肪酶最適溫度為40℃,其活力受溫度、pH和NaCl含量的顯著影響。該研究結(jié)果與文中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相似性,只是考察對(duì)象不同。從本研究結(jié)果可知,硝酸鹽和亞硝酸鹽在0～50mg/kg和0～20mg/kg范圍內(nèi),對(duì)脂肪酶活不產(chǎn)生顯著影響,它們?cè)谏a(chǎn)中的作用可能主要表現(xiàn)為改善產(chǎn)品的色澤,還有報(bào)道認(rèn)為,硝酸鹽和亞硝酸鹽對(duì)干腌火腿的風(fēng)味會(huì)產(chǎn)生影響。表3所示的酸性和中性脂肪酶活分別是在酶的最適生化條件下所測(cè)得的結(jié)果,綜合酶活力則是在pH5.8(生產(chǎn)過程中的平均pH)下測(cè)得的活力,均未考慮生產(chǎn)過程中溫度和鹽含量這2個(gè)酶活的顯著影響因子所產(chǎn)生的作用。因此只能反映潛在的酶活力,而不能反映真實(shí)的酶活,既具體條件下酶真實(shí)的脂解能力。通過響應(yīng)曲面分析既能判定生產(chǎn)過程中酶活力的主要影響因子,又能夠利用回歸方程預(yù)測(cè)生產(chǎn)過程中酶在具體生產(chǎn)條件下的實(shí)際酶活變化,對(duì)科學(xué)分析脂肪酶在生產(chǎn)過程中對(duì)脂類物質(zhì)、風(fēng)味