第三章細(xì)胞生物學(xué)研

第三章細(xì)胞生物學(xué)研第1頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)三、掃描隧道顯微鏡3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第2頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月3一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第3頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月4①光學(xué)放大系統(tǒng)，為兩組玻璃透鏡：目鏡與物鏡；②照明系統(tǒng)：光源、折光鏡和聚光鏡，有時(shí)另加各種濾光片以控制光的波長范圍；③機(jī)械和支架系統(tǒng)，主要是保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制和靈活調(diào)控;對(duì)任何顯微鏡來說，最重要的性能參數(shù)是分辨率，而不是放大倍數(shù)。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)第4頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月5分辨率(resolvingpower):指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離。這個(gè)距離越小分辨本領(lǐng)越高。人眼的分辨力約為100-200μm。顯微鏡分辨率的大小取決于光源波長λ，物鏡鏡口角α（標(biāo)本在光軸的一點(diǎn)對(duì)物鏡鏡口的張角）和介質(zhì)折射率N;它們之間的關(guān)系是：

D＝0.61λ/N.sinα通常α最大值可達(dá)140°，空氣中N＝1，最短的可見光波長λ＝450nm，此時(shí)分辨率D＝292nm，約0.3um。若在油鏡下，N可達(dá)1.5，D則可達(dá)0.2um，所以普通光鏡的最大分辨率是0.2um。由于N.sinα往往是一定值，要提高分辨力只有采用縮短波長的途徑。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第5頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月7普通光鏡樣品的制備：樣品經(jīng)過固定劑（如甲醛等）固定后，包埋到包埋劑（如石蠟等）中，然后切成厚約5um的薄切片。樣品在觀察前一般要經(jīng)過染色，不同的染料對(duì)某種細(xì)胞組分有特異的吸附，如伊紅和美藍(lán)能特異性地與不同蛋白質(zhì)結(jié)合，而品紅則能特異性地顯示出DNA的所在部位。這樣便能形成足夠的反差或產(chǎn)生不同波長的光譜以區(qū)分該種細(xì)胞組分。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第6頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月8相差顯微鏡技術(shù)和微分干涉顯微鏡3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第7頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）相差顯微鏡技術(shù)

光線通過不同密度的物質(zhì)時(shí)，其滯留程度也不同。密度大則光的滯留時(shí)間長，密度小則滯留時(shí)間短。相差顯微鏡（phase－contrastmicroscope）可將這種滯留時(shí)間之差，即光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差。相差顯微鏡的物鏡后裝有一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)（有光程差）的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增添了新的光程差，從而對(duì)樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。第8頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月

在光學(xué)顯微鏡的發(fā)展過程中，相差鏡檢術(shù)的發(fā)明成功，是近代顯微鏡技術(shù)中的重要成就。我們知道，人眼只能區(qū)分光波的波長（顏色）和振幅（亮度），對(duì)于無色通明的生物標(biāo)本，當(dāng)光線通過時(shí)，波長和振幅變化不大，在明場觀察時(shí)很難觀察到標(biāo)本。

相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進(jìn)行鏡檢，也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象，將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹睿词故菬o色透明的物質(zhì)也可成為清晰可見。這大大便利了活體細(xì)胞的觀察，因此相差鏡檢法廣泛應(yīng)用于倒置顯微鏡。第9頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第10頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）可增加樣品反差并且具有很強(qiáng)的立體感。微分干涉顯微鏡更適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。將微分干涉顯微鏡接上錄像機(jī)，可以觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。

第11頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月103/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第12頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月11（二）熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)是以紫外線為光源，使被檢物發(fā)出熒光然后在顯微鏡下觀察其形狀極其所在位置的鏡檢術(shù)。因使用紫外線，波長大大縮短，固可提高分辨力。熒光顯微鏡技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)和熒光素直接標(biāo)記技術(shù)。例如將標(biāo)記熒光素的純化肌動(dòng)蛋白顯微注射人培養(yǎng)細(xì)胞中，可以看到肌動(dòng)蛋白分子裝配成肌動(dòng)蛋自纖維。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第13頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片(一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片)，僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。第14頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月12（三）激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡技術(shù)

普通熒光顯微鏡下，許多來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率降低：激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡（1aserscanningconfocalmicroscopy）大大減少了這種焦平面以外的光，它在某一瞬間只用很小一部分光照明，這一束光通過檢測器前的一個(gè)小孔或裂縫后成像，保證只有來自該焦平面的光成像，而來自焦平面以外的散射光則被小孔或裂縫擋住。激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡成像異常清晰，分辨率可以比普通熒光顯微鏡的分辨率提高1.4～1.7倍。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第15頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月13激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡可自動(dòng)改變觀察的焦平面，而且縱向分辨率（axialresolution）得到改善，所以可以通過“光學(xué)切片”觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將改變焦點(diǎn)獲得一系列細(xì)胞不同切面上的圖像，經(jīng)疊加后便可重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第16頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月17二、電子顯微鏡技術(shù)

（－）電子顯微鏡的基本知識(shí)

電子顯微鏡在基本原理上與光學(xué)顯微鏡完全不同，構(gòu)造也要比光學(xué)顯微鏡復(fù)雜得多，但其光路圖卻十分相近1．電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

使用了波長比可見光短得多的電子束作為光源，波長一般小于0.1nm。由于光源的不同，又決定了電鏡與光鏡的一系列不同點(diǎn)：用電磁透鏡聚焦；電鏡鏡筒中要求高真空；圖像需用熒光屏來顯示或感光膠片作記錄。它們的基本區(qū)別見表。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第17頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月2．電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)人眼的分辨率一般為0.2mm，光學(xué)顯微鏡的分辨率約為0.2um，其放大倍數(shù)為0.2mm／0.2um，即1000倍。電子顯微鏡的分辨率可達(dá)0.2nm,其放大倍數(shù)為106倍。此放大倍數(shù)稱為有效放大倍數(shù)；如繼續(xù)用光學(xué)手段放大也不會(huì)得到任何有意義的信息，因此稱之為“空放大”。第18頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月203．透射電子顯微鏡的基本構(gòu)造①電子束照明系統(tǒng)：包括電子槍、聚光鏡。由高頻電流加熱鎢絲發(fā)出電子，經(jīng)高電壓使電子加速，經(jīng)過聚光鏡匯聚成電子束；②成像系統(tǒng)：包括物鏡、中間鏡與投影鏡等。它們是若干精密加工的中空?qǐng)A柱體，里面裝置線圈，通過改變線圈的電流大小，調(diào)節(jié)圓柱體空間的磁場強(qiáng)度。電子束經(jīng)過磁場時(shí)發(fā)生螺旋式運(yùn)動(dòng)，最終的結(jié)果如同光線通過玻璃透鏡時(shí)一樣，聚焦成像；③真空系統(tǒng)：用兩級(jí)真空泵不斷抽氣，保持電子槍、鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空；④記錄系統(tǒng)：電子成像須通過熒光屏顯示用于觀察，或用感光膠片記錄下來。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第19頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月21（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹1．超薄切片技術(shù)由于電子束的穿透能力有限，為獲得較高分辨率，切片厚度一般僅為40～50nm，即一個(gè)直徑為20um的細(xì)胞可切成幾百片，故稱超薄切片。超薄切片要求樣品既要有一定剛性又要有一定韌性，而生物樣品并不具備這些特性。為此，樣品往往需要包埋在特殊的介質(zhì)中。但包埋的過程會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)；所以超薄切片樣品制備的第一步就是樣品的固定，以便更好地保持細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第21頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月22（1）固定：不僅要求保持樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，有時(shí)甚至要求在超微和分子水平上使細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和組分保持在原來的位置上，同時(shí)盡量保持原來的性質(zhì)，如抗原性等。超薄切片常用的固定劑為鋨酸（OsO4）和戊二醛等（表3－2）。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第22頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月23（2）包埋：使樣品中各種細(xì)微結(jié)構(gòu)在切片過程中都得到均勻良好的支撐；使切成的超薄切片仍能保持連續(xù)完整并且有足夠的強(qiáng)度；能耐受干燥以及觀察時(shí)的電子轟擊、高溫和真空揮發(fā)。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第23頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月包埋劑應(yīng)達(dá)到如下要求：在高倍放大時(shí)不顯示其本身結(jié)構(gòu)；在聚合時(shí)不發(fā)生明顯的收縮，以防止樣品中細(xì)微結(jié)構(gòu)的損壞和移位；具有良好的機(jī)械性能（如剛性和韌性等）以利于切片；易被電子穿透等。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂。

第24頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月25（3）切片超薄切片過程如圖3－5所示。切片厚度通常是40～50nm。切片刀以玻璃或鉆石為材料，最常用的是玻璃刀。切片須撈在覆有支持膜（如透明塑膠膜）的載網(wǎng)（銅網(wǎng)或鎳網(wǎng)）上才能在電鏡下觀察。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第25頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月26（4）染色電鏡樣品僅用重金屬鹽進(jìn)行染色以形成明暗反差，因此，只能通過電子束振幅的改變觀察到黑白圖像。它不能像光鏡切片染色可獲得彩色圖像。圖3－6即是超薄切片技術(shù)顯示的典型動(dòng)物細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第26頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月27AP:appressoriumIS:infectionsacSH:subcuticularhyphaeV.nashicolainfectionbehaviorinpectinlayersin

scab-inoculatedleaves3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第27頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月315.掃描電鏡技術(shù)（scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電鏡的電子槍發(fā)射出的電子束被電磁透鏡匯聚成極細(xì)的電子“探針”，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，電子束可激發(fā)樣品表面放出二次電子（同時(shí)也有一些其他信號(hào)）。二次電子產(chǎn)生的多少與樣品表面的形貌有關(guān)。二次電子由探測器收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變成光信號(hào)，再經(jīng)光電倍增管和放大器又轉(zhuǎn)變成電壓信號(hào)來控制熒光屏上電子束的強(qiáng)度。這樣，樣品不同部位上產(chǎn)生二次電子多或少的差異，直接反映在熒光屏相應(yīng)部位亮或暗的差別，從而得到一幅放大的立體感很強(qiáng)的圖像（圖3－10）。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第28頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月323/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第29頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月333/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第30頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月35第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性五、利用放射性標(biāo)記技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第31頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月36一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物用低滲、超聲破碎或研磨等方法可使細(xì)胞膜破損，形成細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體等細(xì)胞器和細(xì)胞組分的混合勻漿。差速離心（differentia1centrifugation），即利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第32頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月37密度梯度離心是將要分離的細(xì)胞組分小心地鋪放在含有密度逐漸增加的、形成密度梯度的、高溶解性的惰性物質(zhì)（如蔗糖）溶液的表面。在這種條件下進(jìn)行離心，不同組分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉降帶。各顆粒、組分的沉降速率與它們的形狀和大小有關(guān)，通常以沉降系數(shù)（S值）表示。差速離心與密度梯度離心相結(jié)合可以達(dá)到更精細(xì)的分離（圖3－11）。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第33頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月38二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖類與脂質(zhì)等的顯示方法(細(xì)胞化學(xué)的顯示方法)利用一些顯色劑與被檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。例如福爾根（Feulgen）反應(yīng)可以特異顯示DNA的分布;PAS反應(yīng)則可確定多糖的存在;四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，蘇丹III可使脂滴著色（深紅色）。四氧化鋨和蘇丹III可以證明脂肪滴的存在。

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第34頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月39米倫（Millon）反應(yīng)中，氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng)，形成紅色沉淀。AgNO3可特異地顯示rDNA的存在；在進(jìn)行細(xì)胞中某種酶的定性研究時(shí)，由于大多數(shù)固定劑對(duì)酶都有鈍化作用，樣品制備或采用冷凍切片，或以冷丙酮、甲醛進(jìn)行短期固定，以盡量保持酶的活性.

3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第35頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月403/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第36頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月41IdentificationofH2O2generationbyusingenergyfilteringelectronmicroscopy(EFEM)TEMEFEM:CemappingEFEM:OmappingEFEM:PmappingA.alternataappressoriumPenetrationpegH2O2+Ce3+

Ce（OH)2OOHCe（OH)３OOHCeriumperhydroxidesCeriumphosphate?3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第37頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月423/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第38頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月43三、特異蛋白抗原的定位與定性

(一)免疫熒光技術(shù)（immunofluo－rescencetechnigue）

是將免疫學(xué)方法（抗原抗體特異結(jié)合）與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合用來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。它主要包括熒光抗體的制備、標(biāo)本的處理、免疫染色和觀察記錄等過程。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第39頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月Collagen-likesubstancesVitronectin-likesubstancesFibronectin-likesubstancesLaminin-likesubstancesIntegrin-likesubstancesACTH-likesubstancesConidia-±

--±

-Germtubes+++++-Appressoria+++++-CollagenⅥ

-likesubstancesFibronectin-likesubstancesLaminin-likesubstancesConidiumAppressoriumGermtubeVitronectin-likesubstancesIntegrin-likesubstancesACTH-likesubstances（control）BrightfieldFluorescence第40頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月44（二）免疫電鏡技術(shù)

免疫熒光技術(shù)快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。在用抗原抗體反應(yīng)的原理的基礎(chǔ)上，使用電鏡技術(shù)則能有效地提高樣品的分辨率，在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位。膠體金技術(shù)有下列優(yōu)勢：1、金顆粒易識(shí)別，具很高的分辨率；2、可雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第41頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月45四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸序列的定位與定性

原位雜交技術(shù)（insituhybridization）:用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特殊核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置。細(xì)胞內(nèi)特異核酸（DNA或RNA）序列的定性與定位通常采用此法.原位雜交技術(shù)首先是在光鏡水平上開展，近年來，電鏡原位雜交技術(shù)得到了發(fā)展。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第42頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月46電鏡原位雜交的基本原理與光鏡原位雜交類似，只是探針標(biāo)記物不同，以生物素等一些生物小分子代替同位素或熒光素標(biāo)記探針，雜交反應(yīng)的檢測是通過與抗生物素抗體相連的膠體金顆粒顯示出來的。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第43頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月47五、利用放射性標(biāo)記技術(shù)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的合成動(dòng)態(tài)20世紀(jì)70年代初，Caro用3H-亮氨酸對(duì)豚鼠胰腺的腺泡細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記：在脈沖標(biāo)記3min后，放射自顯影銀粒主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；20min后，銀粒出現(xiàn)在高爾基體；120min后則位于分泌泡并開始在頂端釋放。（圖）3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第44頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月48實(shí)驗(yàn)說明了分泌性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)途徑：蛋白質(zhì)的合成是在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上進(jìn)行：新合成的蛋白質(zhì)隨即轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中；從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)再轉(zhuǎn)移到高爾基體，收集包裝成酶原顆粒：酶原顆粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞頂端釋放于細(xì)胞之外。3/4/12細(xì)胞生物學(xué)-研究方法第45頁，課件共51頁，創(chuàng)作于2023年2月