通心絡(luò)膠囊對大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡及caspase-3、p53、hsp70蛋白及其mrna表達的影響

通心絡(luò)膠囊對大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡及caspase-3、p53、hsp70蛋白及其mrna表達的影響

近年來的結(jié)果表明，細胞壞死是缺血性腦損傷中不同形式細胞壞死的一部分。神經(jīng)細胞壞死的程度與缺血性腦損傷的長期預(yù)后密切相關(guān)。腦損傷后的死亡在腦損傷生成機制中起著重要作用。通心絡(luò)膠囊是在中醫(yī)絡(luò)病理論指導(dǎo)下研發(fā)的代表性中藥復(fù)方制劑,由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍等藥物組成,具有益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效,已廣泛用于心腦血管病治療,尤其在治療缺血性腦卒中取得良好效果。該實驗采用流式細胞、Westernblot及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)觀察通心絡(luò)對大腦中動脈栓塞(MCAO)模型大鼠腦缺血后神經(jīng)細胞凋亡率和caspase-3、P53和HSP70蛋白及其mRNA表達的影響,以探討通心絡(luò)膠囊對缺血腦保護作用的可能機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物清潔級SD雄性大鼠,體重250～310g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證編號:SCXK(京)2002-0003]。1.1.2nmda抗劑通心絡(luò)原粉(河北石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司),N-甲基-D天冬氨酸(NMDA)拮抗劑MK-801(北京舒伯偉化工儀器有限公司),caspase-3鼠源性單克隆抗體(Zymed公司),P53兔源性多克隆抗體(Santa公司),HSP70鼠源性單克隆抗體(Sigma公司)。1.1.3儀器、檢測設(shè)備20PI-52D低溫高速離心機(日立公司),PTC-200型PCR儀(美國PE公司),EpicsXL型流式細胞儀(日立公司),UVP凝膠掃描分析系統(tǒng)(美國UVP公司),DYY-Ⅲ-6B型電泳儀(北京六一儀器廠)。1.2方法1.2.1實驗?zāi)Ｐ偷闹苽鋵游镫S機分為假手術(shù)組、MACO模型組、MK-801組及通心絡(luò)大、小劑量治療組5組,每組40只。參照Bederson等方法并加以改進,采用線栓法制備MCAO模型。假手術(shù)組僅行頸總動脈和頸內(nèi)動脈分離。造模成功后,MK-801組按體重0.5mg/(kg·d)腹腔注射MK-801,1次/d;通心絡(luò)大、小劑量治療組分別按體重1.0、0.5g/(kg·d)給予通心絡(luò)原粉水溶液灌胃,2次/d;假手術(shù)組和MACO模型組給予等體積生理鹽水灌胃,2次/d。各組動物分別于術(shù)后6、12、24、48、72h分批處死(n=8),采集標本進行相關(guān)指標檢測。1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞的表達采用生理鹽水沖洗腦組織塊,剪碎,研磨并用200目銅網(wǎng)過濾收集懸液,以1000r/min離心10min,棄上清。取1×106個細胞約100μL,加入0.5%(質(zhì)量濃度)胃蛋白酶2mL,37℃消化10～20min,加PBS終止消化,以1000r/min離心5min,棄上清。用EB染液染色20min,以4℃500目銅網(wǎng)過濾,濾液經(jīng)流式細胞儀(FCM)檢測。以亞二倍體峰判定細胞凋亡并計算細胞凋亡百分率(apoptosisrates,AR)。1.2.3硝酸鹽纖維素膜的t-ts-水質(zhì)活化腦組織胞質(zhì)蛋白提取液與點樣緩沖液等體積混勻煮沸,變性10min;12%(質(zhì)量濃度)聚丙酰胺凝膠電泳穩(wěn)壓,4℃約4h;轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡硝酸纖維素膜和濾紙15min,轉(zhuǎn)移緩沖液平衡5min,4℃約2h;膜用T-TBS漂洗,5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉封閉,室溫下振蕩2h,將稀釋一抗涂在膜的蛋白面上,置4℃封閉過夜;T-TBS漂洗10min×3次,加稀釋二抗,37℃振蕩1h,化學(xué)發(fā)光試劑顯色10～20min,自來水終止反應(yīng)。1.2.4pcr檢測rnamRNA表達的測定:(1)總RNA的提取:取凍存的腦組織于冰盤研缽中研磨,充分碎裂后加Trizol(100mg組織/mL),室溫放置5min。于4℃以12000r/min離心10min。取上清加入氯仿充分搖勻15s,室溫放置1.5min。于4℃以12000r/min離心15min。將上層水相移入另一個預(yù)冷的離心管中,按0.5mL異丙醇/mLTrizol加入異丙醇混勻。于4℃以12000r/min離心10min。棄上清,按1mL75%(體積分數(shù))乙醇/mLTrizol加入乙醇,充分振蕩后于4℃以4500r/min離心5min。移去上清,室溫晾干5～10min,加入50μL無RNA酶水溶解RNA樣品,貯存于-20℃冰箱備用。(2)引物設(shè)計:引物的合成經(jīng)查找文獻自行設(shè)計,并由北京賽百盛基因有限公司合成。(3)RT-PCR:取1μL總RNA,加入10mmol/LdNTP、0.5g/LOligodT、5UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶、21URnase抑制劑、5×RT緩沖液,以DEPC-H2O將總反應(yīng)體積補至20μL,42℃反應(yīng)1h后于95℃加熱5min。取2μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,分別加入5mmol/LdNTP、10×PCR緩沖液、25pmol寡核苷酸引物、2UTaqDNA聚合酶,使用DEPC-H2O將體積補至25μL。引物的變性、退火和延伸溫度分別為94℃、X℃(β-actin為55℃,caspase-3為48℃,P53為53℃,HSP70為47℃)和72℃,反應(yīng)時間均為45s,共進行30個循環(huán)。取上述產(chǎn)物經(jīng)1.5%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖電泳,采用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描,計算各種基因表達量與其相對應(yīng)β-actin表達量的比值。1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,采用SPSS11.0軟件統(tǒng)計行單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD法檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠腦神經(jīng)損傷的情況比較各時間點模型組細胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組比較,通心絡(luò)治療組、MK-801組均可明顯降低缺血后大鼠腦神經(jīng)細胞凋亡百分率(P<0.05,P<0.01),通心絡(luò)大劑量組效果尤為顯著(P<0.01)(表1,圖1)。2.2通心絡(luò)小劑量對大鼠血清中兩種表達的影響模型組caspase-3及P53蛋白表達較假手術(shù)組明顯增高;與模型組比較,通心絡(luò)組和MK-801組二者表達則明顯減少,尤以通心絡(luò)大劑量組減少最顯著,通心絡(luò)小劑量組、MK-801組二者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組比較,各治療組HSP70蛋白表達明顯增高,以通心絡(luò)大劑量組增高最為顯著,其次是通心絡(luò)小劑量和MK-801組(圖2～4)。2.3通心絡(luò)小劑量對各組大鼠血清中通心絡(luò)小劑量的影響模型組caspase-3mRNA及P53mRNA表達較假手術(shù)組明顯增強(P<0.01),通心絡(luò)治療組、MK-801組其表達與模型組比較均明顯減弱(P<0.01),以通心絡(luò)大劑量組減弱最顯著(P<0.05),通心絡(luò)小劑量組與MK-801組二者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組HSP70mRNA表達較假手術(shù)組增強(P<0.01),通心絡(luò)治療組、MK-801組表達與模型組比較均明顯增強(P<0.01),以通心絡(luò)大劑量組HSP70mRNA表達增強更為明顯(P<0.05)(表2)。3通心絡(luò)對日本外周血caspase-3和hsp70表達的影響細胞凋亡是細胞為維持其內(nèi)穩(wěn)態(tài),對內(nèi)外環(huán)境刺激或死亡信號觸發(fā)做出由基因控制的細胞自主性程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)。腦缺血后神經(jīng)細胞死亡除有一般認為的壞死還存在凋亡形式,抑制缺血后神經(jīng)細胞凋亡對保護神經(jīng)元具重要意義。有研究結(jié)果顯示,NMDA拮抗劑MK-801能抑制腦損傷后組織caspase-3的激活,減輕神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。該研究以MK-801為對照初步探討了中藥通心絡(luò)對缺血腦保護的作用機制,結(jié)果顯示MCAO模型組大鼠神經(jīng)細胞凋亡百分率各時間點均明顯高于假手術(shù)組,各治療組均可降低凋亡率,且以通心絡(luò)大劑量治療組神經(jīng)保護作用尤為突出。caspase-3是細胞凋亡的核心,各種可引起凋亡的因素如Fas死亡因子、腫瘤壞死因子等均需通過激活caspase-3才能發(fā)揮作用,并最終導(dǎo)致腦細胞發(fā)生不可逆的凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型缺血周邊區(qū)及海馬等caspasemRNA及其相應(yīng)蛋白表達增加。該研究發(fā)現(xiàn)模型組腦組織中caspase-3及缺血側(cè)皮層caspase-3mRNA表達明顯增強,治療組表達較模型組明顯減弱,其中以通心絡(luò)大劑量治療組最為明顯,結(jié)果表明通心絡(luò)能抑制神經(jīng)細胞凋亡的核心因子caspase-3轉(zhuǎn)錄及表達,這可能是其通過抑制細胞調(diào)亡進而發(fā)揮缺血腦保護作用的可能機制之一。關(guān)于假手術(shù)組皮質(zhì)caspase-3少量轉(zhuǎn)錄及表達,可能與手術(shù)機械刺激引起腦血管痙攣而發(fā)生一過性腦缺血有關(guān)。P53是一種致死基因,野生型的P53基因(wt-P53)對細胞凋亡有促進作用,被認為是誘導(dǎo)腦缺血細胞凋亡機制的主要因素。該研究檢測的P53蛋白主要位于損傷后出現(xiàn)細胞凋亡的位置,因此該實驗檢測的為野生型P53蛋白。研究表明,腦缺血后P53mRNA及其蛋白在缺血區(qū)TUNEL陽性神經(jīng)元表達增加,如抑制P53表達可對腦缺血有保護作用。該研究結(jié)果顯示,模型組于缺血后各時間點梗死灶周邊區(qū)有大量P53表達,并于24h達高峰,經(jīng)藥物干預(yù)后各組對缺血后P53的表達有顯著抑制作用,且通心絡(luò)大劑量治療組與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;模型組缺血側(cè)皮層P53mRNA表達明顯增強,各治療組表達均明顯減弱,其中以通心絡(luò)大劑量組最為明顯,提示通心絡(luò)的腦保護機制之一可能是通過抑制P53的轉(zhuǎn)錄及表達減少了細胞凋亡而實現(xiàn)。HSP基因是存在于動、植物和微生物體內(nèi)高度保守的基因家族,在熱損傷及其他因素引起的損傷情況下可被誘導(dǎo)表達。HSP70是HSP家族中等相對分子質(zhì)量蛋白,目前被普遍認為是一類應(yīng)激保護性蛋白。在腦缺血情況下,HSP可作為應(yīng)激反應(yīng)的一個標志。HSP70蛋白的表達可提高神經(jīng)細胞對缺血的耐受性,并可能抑制細胞凋亡,維持細胞的自身穩(wěn)定,現(xiàn)已被公認為是對缺血性損傷具保護作用的應(yīng)激蛋白,在保護外界或缺血損傷、促進腦細胞修復(fù)中起重要作用。若早期基因產(chǎn)物HSP在腦缺血區(qū)合成增強則對腦缺血損傷的修復(fù)及預(yù)后具有重要意義。該研究結(jié)