p38絲裂原活化蛋白激酶通路在絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)中的作用

p38絲裂原活化蛋白激酶通路在絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白表達(dá)中的作用

血管內(nèi)功能障礙是血管病變的初始因素，通常貫穿整個(gè)血管病變的整個(gè)過程。因此，對(duì)血管內(nèi)功能障礙的研究可以對(duì)預(yù)防和治療血管疾病具有積極意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管壁內(nèi)表面,是血管壁與血液間的分界細(xì)胞,其形態(tài)結(jié)構(gòu)受損或功能改變導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能的損害,促進(jìn)血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[1、2]。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞骨架與血管內(nèi)皮通透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān),對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能有重要意義。纖維狀肌動(dòng)蛋白(filamentousactin,F-actin)是細(xì)胞骨架中的主要收縮蛋白,其含量減少,可以使內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性增加,導(dǎo)致血管屏障功能的損害,其中p38MAPK通路與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管通透性關(guān)系密切[4、5]。但是,在病證復(fù)合模型大鼠血清誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞骨架的變化、內(nèi)皮通透性增高的過程中,p38MAPK通路的作用如何,目前尚未見研究報(bào)道。另外通心絡(luò)能改善血管內(nèi)皮功能,對(duì)血管性疾病有很好的防治作用[6、7],但其改善內(nèi)皮功能是否與改善p38MAPK通路的活性有關(guān)?本研究使用絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型大鼠血清培養(yǎng)HUVEC,觀察其對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響,并探討p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否在該過程中發(fā)揮作用及通心絡(luò)改善血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制。1材料和方法1.1材料、試劑與儀器健康雄性Wistar大鼠,體重220g~250g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(京)2007-0001);HUVEC細(xì)胞株(ATCC編號(hào)CRL-1730):人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株購于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心);F12K培養(yǎng)基購于Gibco公司;SB203580,美國(guó)biosource公司;RIPA蛋白裂解液,北京Solarbio公司;抗人F-actin抗體,英國(guó)abcam公司;抗人p38MAPK單克隆抗體,美國(guó)CellSignaling公司;磷酸化p38MAPK單克隆抗體,美國(guó)CellSignaling公司;通心絡(luò)由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;凝膠成像分析儀,美國(guó)Biorad公司;DYY-8C型電泳儀,北京市六一儀器廠;Minispin離心機(jī),德國(guó)eppendorf公司。1.2運(yùn)動(dòng)目標(biāo)絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型的建立:連續(xù)喂養(yǎng)雄性Wistar大鼠3%高蛋氨酸飼料(不限食)4周后,施加力竭游泳因素,每只造模大鼠在給予5%的上述飼料條件下在25℃~27℃水溫的自制游泳缸(60cm×40cm×100cm)中,每日強(qiáng)迫負(fù)重(按每只造模大鼠自身體重的5%計(jì)算)游泳,采取2次游泳法,前后相差10min,游泳至力竭為止,以最大限度耗竭動(dòng)物體力(力竭標(biāo)準(zhǔn)[9、10]:游泳范圍逐漸縮小,動(dòng)作明顯失調(diào)、慌張,鼻部在水面上下浮動(dòng),頭部沒入水面下10s不能上浮為力竭標(biāo)準(zhǔn)),連續(xù)游泳訓(xùn)練14d。絡(luò)氣虛滯型內(nèi)皮功能障礙模型建立(表現(xiàn)為精神萎靡,眼瞼下垂,反應(yīng)遲鈍;全身毛發(fā)枯槁,豎立,皮膚松弛,皮下少有脂肪,甚至抓之觸骨;鼻尾顏色可見蒼白等)。正常大鼠和絡(luò)氣虛滯型內(nèi)皮功能障礙模型大鼠分別取血后離心并收集血清,56℃滅活30min,而后進(jìn)行過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3%模型大鼠血清實(shí)驗(yàn)分5組:(1)空白對(duì)照組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20%的胎牛血清;(2)正常血清組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20%的正常大鼠血清;(3)模型血清組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中加入終濃度為20%的模型大鼠血清;(4)通心絡(luò)組:無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入終濃度為1μg/ml通心絡(luò)預(yù)處理6h,然后加入終濃度為20%的模型大鼠血清;(5)SB203580組:于無血清培養(yǎng)基(F12K)中先加入SB203580(p38阻斷劑,終濃度:25umol/L)孵育,1h后加入20%模型大鼠血清。各項(xiàng)觀察與檢測(cè)均在血清作用后6h進(jìn)行。1.4總蛋白表達(dá)動(dòng)力學(xué)Westernblot技術(shù)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞骨架蛋白F-actin、p38、P-p38蛋白的含量。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)刺激HUVEC后,加入0.1mlRIPA裂解液冰上裂解30min,4℃3000r/min,離心20min吸取上清,BCA法測(cè)定總蛋白濃度,用樣品緩沖液稀釋至5μg/μl。取100μg的蛋白樣品于12%的SDS凝膠中進(jìn)行電泳,待目的蛋白接近凝膠底部時(shí)停止電泳,4℃120V恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1h。分別加入1∶1000稀釋的p38MAPK、phospho-p38MAPK、F-actin一抗和1∶500稀釋的β-actin(內(nèi)參)一抗,4℃孵育過夜,TBST洗膜10min×3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1000)室溫孵育1h,TBST洗膜5min×3次。ECL發(fā)光顯色,凝膠成像系統(tǒng)照相,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用quantityone軟件分析,掃描光密度(OD)值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示。1.5組間差異及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示(x珋±SD),組間差異用單因素方差分析One-WayANOVA程序進(jìn)行分析處理,有顯著差異者進(jìn)一步用最小顯著差異法行兩兩之間比較,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1血清f-actin蛋白表達(dá)情況與對(duì)照組及正常血清組比較,模型血清組F-actin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),phospho-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01,P<0.05),p38蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。與模型血清組相比,通心絡(luò)組和SB203580組F-actin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01),phospho-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖1、表1)。這提示F-actin蛋白表達(dá)的變化可能與p38MAPK信號(hào)通路激活有關(guān),且通心絡(luò)可能通過抑制p38MAPK信號(hào)通路參與了這一病變過程。3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響中醫(yī)證候如何在離體水平研究一直是中醫(yī)證候研究的難點(diǎn),目前尚缺乏在離體細(xì)胞水平施加病證復(fù)合因素的細(xì)胞模型,嚴(yán)重阻礙了證候的病理生理學(xué)機(jī)制的深入研究。本實(shí)驗(yàn)以HUVEC為實(shí)驗(yàn)材料,以絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙病證復(fù)合模型大鼠血清作為損傷因素,建立了反映人類血管內(nèi)皮功能障礙病證特點(diǎn)的較為理想的細(xì)胞模型。這一模型,無需對(duì)病因模擬,提供了理想的體現(xiàn)“病”、“證”結(jié)合特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型,為更深入的實(shí)驗(yàn)研究打下了基礎(chǔ),同時(shí)也為中醫(yī)病證復(fù)合細(xì)胞模型的建立提供了方法學(xué)上的借鑒,具有深遠(yuǎn)的科研價(jià)值。細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要結(jié)構(gòu),F-actin是細(xì)胞骨架中的重要部分,其基本結(jié)構(gòu)單位是纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin),F-actin的完整對(duì)于維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能是必須的。F-actin是細(xì)胞骨架中的主要收縮蛋白,它的含量減少,可以導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)不能維持,從而使內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性增加,導(dǎo)致血管屏障功能的損害,使血液中的脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)更易通過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步形成泡沫細(xì)胞,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn),細(xì)胞運(yùn)用這一系統(tǒng)把細(xì)胞外刺激傳遞到胞核,介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng),在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞屏障中起重要作用。哺乳動(dòng)物MAPK傳導(dǎo)通路主要有5條,其中p38MAPK通路與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管通透性關(guān)系密切。目前己知p38有a、β、γ、δ4種亞型,內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)p38a、β,且SB203580是特異的p38a和P38β的阻滯劑,因具有選擇性高、效力強(qiáng)大等特點(diǎn),故國(guó)內(nèi)外大都用其研究p38MAPK通路。本研究結(jié)果顯示,在干預(yù)6h時(shí)間點(diǎn),westernblot檢測(cè)結(jié)果,與對(duì)照組及正常血清組比較,復(fù)合模型血清組F-actin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),SB203580組能夠顯著上調(diào)F-actin蛋白的表達(dá)(P<0.01);與復(fù)合模型血清組比較,通心絡(luò)組和B203580組phospho-p38的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),而p38在各組中均無明顯變化(P>0.05)。上述結(jié)果提示,在干預(yù)組中總的p38在干預(yù)前后并無變化,只是phospho-p38發(fā)生了變化,說明p38MAPK信號(hào)通路的激活參與了絡(luò)氣虛滯型血管內(nèi)皮功能障礙模型大鼠血清誘導(dǎo)的F-actin含量的變化,及通心絡(luò)可能通過抑制p38MAPK信號(hào)通路而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞