蛇床子素抑制血栓形成和血小板聚集的實驗研究

蛇床子素抑制血栓形成和血小板聚集的實驗研究

蛇床子素也被稱為甲基歐芹酚（ost），是從傘科植物的蛇床子成熟的果實蛇床子中提取的。它的化學(xué)特征是7-甲基-8-異戊烯基香豆素。文獻報道蛇床子素對心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、抗腫瘤等方面有廣泛的藥理作用。本文以實驗性血栓形成和血小板聚集為指標,觀察蛇床子素的抗血栓作用,目前國內(nèi)外尚無這方面的研究報道。1材料表面1.1體重、體重Wistar大鼠,♂,體重200~250g;昆明種小鼠,♂,體重18~22g。均由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供,清潔級,實驗動物生產(chǎn)許可證:XCYK(蘇)2002-0008,實驗動物使用許可證:SYXK(蘇)2002-0037。1.2承載物、激素的藥物及藥物蛇床子素(純度為95%,西安綠泉生物技術(shù)有限公司提供,體內(nèi)給藥時用體積分數(shù)為0.002的吐溫-80配制,體外實驗用體積分數(shù)為0.05的二甲亞砜配制);復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司);膠原-腎上腺素合劑(分別購自Sigma公司和上海禾豐制藥有限公司。臨用時稱取膠原蛋白45mg,浸泡于3~4ml生理鹽水中2h以上,勻漿,1000×g離心10min,取上清液;另取1g·L-1的腎上腺素1.8ml,加入上清中,加生理鹽水至40ml即成);ADP(北京世帝科學(xué)儀器公司);凝血酶(珠海經(jīng)濟特區(qū)生物化學(xué)制藥廠);花生四烯酸鈉(Sigma公司);丹參注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司)。1.3儀器TYXN-96多功能智血液凝聚儀(上海通用機電技術(shù)研究所)。2方法2.1蛇床子素的灌胃將大鼠隨機分成五組:①陽性藥物對照組:復(fù)方丹參滴丸(CoumpoundDanshenDrippingPills,CDDP)溶液灌胃(62.5mg·kg-1·d-1);②③④蛇床子素組,分別以10,20,40mg·kg·d-1蛇床子素溶液灌胃;⑤模型組:以等體積的體積分數(shù)為0.002的吐溫-80溶液灌胃。連續(xù)給藥10d,在末次給藥后0.5h,參照文獻方法制成動-靜脈旁路血栓形成模型。即麻醉大鼠,取三段聚乙烯管組成套管,中間套管內(nèi)置一預(yù)先稱重的6cm長絲線。管的一端插入大鼠的左頸外靜脈后,向管腔內(nèi)注入肝素(50U·kg-1),然后再將管的另一端插入右側(cè)頸總動脈。開放血流,15min后中斷血流,迅速取出絲線并稱重。血栓濕重由總重量減去絲線干重表示。然后將血栓放入70℃烘箱,2h后稱干重。血栓干重由總重量減去絲線干重表示,并按下式計算血栓形成抑制率:血栓形成抑制率(%)=模型組血栓重量-給藥前血栓重量模型組血栓重量×100%2.2蛇床子素及吐溫-80溶液將小鼠隨機分成五組:①陽性藥物對照組:阿司匹林(aspirin)溶液灌胃(20mg·kg·d-1);②③④為蛇床子素組,別以10,20,40mg·kg·d-1蛇床子素溶液灌胃;⑤模型組:以等體積的體積分數(shù)為0.002的吐溫-80溶液灌胃。連續(xù)給藥7d,在末次給藥后0.5h,尾靜脈注入膠原-腎上腺素混合溶液0.01ml·g-1,觀察5min內(nèi)小鼠的死亡數(shù)和15min內(nèi)小鼠偏癱的恢復(fù)數(shù),計算小鼠的死亡率和藥物對小鼠偏癱的保護率。2.3血小板聚集測定取健康志愿者新鮮血液,按本室常法制備富血小板血漿(plateletrichplasma,PRP)或血小板懸液,用Born’s比濁法測定血小板聚集性。在200μlPRP或血小板懸液中加入不同濃度的蛇床子素溶液,陽性藥為丹參注射液(DanshenZhusheye,DZ),溶媒對照為體積分數(shù)為0.05的二甲基亞砜溶液。37℃溫育5min后,分別加入濃度為112.5μmol·L-1的ADP5μl、5U·ml-1的凝血酶20μl、32mmol·L-1的花生四烯酸鈉5μl后描記5min血小板聚集曲線,觀察1、3、5min時聚集率和最大聚集率。所有樣本的血小板聚集測定均在3h內(nèi)完成。聚集抑制率(aggregativeinhibitionrate,AIR)按下式計算,以抑制百分率為縱坐標,不同藥物濃度為橫坐標進行直線回歸,按直線回歸方程計算抑制50%血小板聚集的相應(yīng)藥物濃度(IC50),并以此比較藥物對不同誘導(dǎo)劑產(chǎn)生血小板聚集作用的大小。血小板聚集抑制率(%)=溶媒管最大聚集率-給藥管最大聚集率溶媒管最大聚集率×100%2.4數(shù)據(jù)處理血栓重量和血小板聚集率用ˉx±s表示,組間的顯著性差異用t檢驗;率的比較用χ2檢驗。3結(jié)果3.1蛇床子素對大鼠血栓形成的影響大鼠連續(xù)10d給藥后,蛇床子素10、20、40mg·kg-1組的血栓濕重和干重與模型組相比均明顯降低。表明蛇床子素對大鼠體內(nèi)血栓形成有明顯的抑制作用,但高中低劑量組間的量效關(guān)系不明顯。見Tab1。3.2動物死亡數(shù)及小鼠恢復(fù)數(shù)給予蛇床子素10、20、40mg·kg-17d的小鼠,對注射膠原-腎上腺素5min內(nèi)誘導(dǎo)體內(nèi)血栓形成所致的動物死亡數(shù)與模型組相比均明顯降低,15min內(nèi)偏癱小鼠恢復(fù)數(shù)與模型組相比也明顯增加。表明蛇床子素對膠原-腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠血栓性偏癱或死亡具有一定的保護作用。見Tab2。3.3種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用用健康人血,ADP、凝血酶、花生四烯酸鈉作誘導(dǎo)劑,結(jié)果各個濃度下的蛇床子素對三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集均有不同程度的抑制作用,其IC50分別為0.444、0.186、0.421g·L-1。由此可見蛇床子素對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用最強,對ADP和花生四烯酸鈉的抑制作用基本相同。見Tab3,4,5。4抗凝血藥的合成展望血栓栓塞性疾病是嚴重危害公眾健康的常見病與多發(fā)病,是腦卒中、冠心病、動脈粥洋硬化等致殘和致死率高的心腦血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。目前現(xiàn)有的抗血栓藥物依作用機制可分為抗凝血藥、抗血小板藥和纖維蛋白溶解藥?？鼓幇ǜ嗡?AT-Ⅲ及直接抗凝血酶藥,組織因子途徑抑制劑等。其中肝素不能抑制與纖維蛋白結(jié)合的凝血酶,已成為血栓復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。近年來,低分子量肝素及凝血酶抑制劑的研制,雖使抗凝血藥的療效與安全性有所提高,但總的來說,尚無理想的抗凝血藥供臨床使用;抗血小板藥包括環(huán)氧酶抑制劑,TXA2受體阻滯劑和TXA2合成酶抑制劑,血小板GPⅡb/Ⅲa受體阻滯劑等。此類藥物或作用不強,或半衰期太短,或無法口服等,限制其廣泛應(yīng)用;纖維蛋白溶解藥包括第Ⅰ代的鏈激酶、尿激酶等,第Ⅱ代的t-PA、阿尼普酶等,第Ⅲ代制劑如改造野生型t-PA、組建嵌合型溶栓劑、單克隆抗體導(dǎo)向溶栓劑等。此類藥物雖經(jīng)歷3代的研制和發(fā)展,溶栓效果和特異性逐漸有所改善,但尚未取得實質(zhì)性和突破性進展,有不同程度的出血、再灌注損傷、過敏反應(yīng)等副作用和溶栓后再栓塞等缺陷,以及用藥時機和劑量不易掌握等問題。因此,研制有效、安全、適合于長期甚至終生服用的口服抗血栓藥物具有重要意義。我國中醫(yī)藥研究表明,大量植物來源的單體化合物具有確切的抗血栓作用,與目前已經(jīng)上市的抗血栓西藥和生物技術(shù)產(chǎn)品相比,天然中草藥安全性好,口服有效。因此,發(fā)展純天然的抗血栓藥物是目前研制新型抗血栓藥物的有效途徑。蛇床子素藥理作用廣泛,但對體內(nèi)的抗血栓形成和抑