水稻RACK1蛋白的定位研究

水稻RACK1蛋白的定位研究

姓名：甄萍萍導(dǎo)師：梁建生專業(yè):植物學(xué)

綜述

水稻是人類主要糧食作物之一，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)環(huán)境的改變，水稻生產(chǎn)受到越來(lái)越多的不利因素的限制，如病蟲害、環(huán)境污染、水資源的短缺等，嚴(yán)重制約了水稻的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，所以必須進(jìn)行品種改良，其中一個(gè)方向就是對(duì)水稻抗旱品種的開發(fā)研究。干旱脅迫可引起植物細(xì)胞一系列形態(tài)和生理生化響應(yīng)，植物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，形成了一系列主動(dòng)響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制。植物細(xì)胞通過(guò)感受外界刺激將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，響應(yīng)外界刺激。G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與許多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)響應(yīng)，該系統(tǒng)中的G-蛋白就參與了植物響應(yīng)干旱脅迫和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)等調(diào)節(jié)作用。

WD40重復(fù)蛋白是一個(gè)具有高度保守基序但具有多種功能的大家族。異三聚體G蛋白β亞基屬于WD40重復(fù)蛋白。Dell等通過(guò)酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)了G蛋白βγ亞基可能的新效應(yīng)分子，即活性C激酶1受體(ReceptorforActivatedCKinase1,RACK1)、動(dòng)力蛋白中間鏈和一個(gè)未知功能的蛋白質(zhì)(GeneBank登陸號(hào)為AAH20044)。這些蛋白質(zhì)都具有WD40重復(fù)。RACK1在廣大物種中是高度保守的；研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物和植物中都存在RACK1同源物的蹤跡，如豬、非洲爪蟾、鼠、大豆、山毛櫸等。ChenJG等(2006)在分析魚、昆蟲和真菌的EST數(shù)據(jù)庫(kù)和基因組時(shí)均發(fā)現(xiàn)了RACK1同源物。植物中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RACK1同源基因是煙草BY-2懸浮細(xì)胞中的一個(gè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因arcA，之后在擬南芥、水稻、煙草、番茄、苜蓿和藻類中都發(fā)現(xiàn)了RACK1同源基因的存在。煙草和番茄中至少有兩種RACK1同源物。

報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列融合形成嵌合基因，或與其他目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選轉(zhuǎn)化體。目前研究中曾用過(guò)的報(bào)告基因有:β-半乳糖苷酶(β-Lac),氯霉素乙酸轉(zhuǎn)移酶(CAT)、新霉素乙酞轉(zhuǎn)移酶(NPII)、熒光素酶(Lux)、和β-葡萄糖苷酶(β-GUS)等。但這些傳統(tǒng)的報(bào)告基因有著許多的不足。GUS基因所用的檢測(cè)底物成本較高，且會(huì)對(duì)細(xì)胞造成毒害，染色中的一些物理，化學(xué)步驟會(huì)損傷細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，其中間反應(yīng)的擴(kuò)增也會(huì)影響葡萄糖苷酶本身的在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確定位;以熒光素酶基因作報(bào)告基因檢測(cè)時(shí)需加入熒光素，熒光素可在機(jī)體內(nèi)隨質(zhì)流移動(dòng)，使其往往難以準(zhǔn)確地指示熒光素酶基因的特異性表達(dá)部位;而β-半乳糖苷酶基因作報(bào)告基因需要外源底物X-gal和誘導(dǎo)物IPTG的參與，故成本高，且操作繁瑣。新霉素、氯霉素基因作報(bào)告基因的編碼產(chǎn)物對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體的幼胚存在一定的毒副作用。

綠色熒光蛋白(GFP)是存在于發(fā)光水母體內(nèi)，它是一種吸收藍(lán)光或紫外光后發(fā)出綠色熒光的天然蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)在表達(dá)時(shí)可自身催化形成熒光基團(tuán)，而且不需要添加任何底物或輔助因子，這樣它就可以免除在檢測(cè)時(shí)底物對(duì)細(xì)胞造成的一些物理、化學(xué)損傷，降低了添加的輔因子在對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行觀察時(shí)造成的假象，同時(shí)又降低了檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了繁瑣操作。因此，在轉(zhuǎn)基因研究中，利用GFP作報(bào)告基因則可以大大提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的成功率，減少轉(zhuǎn)基因個(gè)體篩選、鑒定方面的工作量。植物基因工程的基本路線

(1)目的基因的分離(2)將目的基因克隆到適當(dāng)?shù)妮d體DNA中形成重組DNA，并且連接了一個(gè)控制目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的啟動(dòng)子和一個(gè)控制目的基因轉(zhuǎn)錄終止的終止子，還連接一個(gè)編碼特殊蛋白質(zhì)（如熒光蛋白）的標(biāo)記基因。(3)利用細(xì)菌繁殖擴(kuò)增重組DNA。(4)利用基因槍、農(nóng)桿菌等方法將連接了啟動(dòng)子和終止子的目的基因?qū)氲侥繕?biāo)植物的細(xì)胞中。(5)篩選含有外源基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。(6)大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因植物。選題意義

對(duì)擬南芥AtRACK1的研究表明，AtRACK1參與了植物對(duì)干旱脅迫信號(hào)的響應(yīng)過(guò)程，并且與植物的忍耐干旱密切相關(guān)。與AtRACK1蛋白的氨基酸序列為模板對(duì)水稻基因組序列進(jìn)行比對(duì)，我們找到兩個(gè)與編碼ATRACK1基因高度同源的基因（NP-916988和XP-475866）。在蛋白質(zhì)水平兩者與ATRACK1蛋白的同一性和相似性分別達(dá)到70%和80%。推測(cè)水稻的RACK1（OsRACK1）可能與擬南芥RACK1（ATRACK1）具有相似的功能。

本實(shí)驗(yàn)室以往的研究雖然證明rack1基因影響植物忍耐干旱的能力，通過(guò)研究水稻rack1過(guò)表達(dá)植株及突變體植株得知，OsRACK1與水稻抗旱能力成正相關(guān)，但對(duì)其機(jī)理不是很清楚。本研究試圖從OsRACK1基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位區(qū)域來(lái)探討OsRACK1基因的作用機(jī)理。

研究方案

實(shí)驗(yàn)采用與gfp構(gòu)建融合基因，用熒光顯微鏡觀察的方法進(jìn)行OsRACK1的定位研究。為了了解OsRACK1的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建rack1與gfp的融合基因，將融合基因構(gòu)建成表達(dá)載體，另外再構(gòu)建對(duì)照載體pCAMBIA1301-GFP。將兩個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。使用熒光顯微鏡觀察GFP的綠色熒光來(lái)確定OsRACK1的亞細(xì)胞定位。研究技術(shù)路線目的基因rack1載體報(bào)告基因gfp載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因水稻的亞細(xì)胞定位檢測(cè)具體方法（1）表達(dá)載體的構(gòu)建①rack1目的基因的克?。═-A克?。趃fp基因的克隆（T-A克?。踦CAMBIA-RACK1-GFP融合基因表達(dá)載體和對(duì)照載體pCAMBIA-GFP的構(gòu)建

用Kpn1和BamH1酶切rack1基因，用Spe1和Kpn1酶切g(shù)fp基因，將兩者插入至pCAMBIA1301的BamH1和Spe1酶切位點(diǎn)，構(gòu)成重組質(zhì)粒，即融合基因表達(dá)載體。

(2)植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105

采用凍融直接轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的植物表達(dá)