報(bào)道基因 簡(jiǎn)介

報(bào)道基因SEAP的應(yīng)用一、報(bào)告基因的概況二、SEAP（分泌型堿性磷酸酶）報(bào)告基因(reportergene)是表型易于檢測(cè)并易于與內(nèi)源性背景蛋白質(zhì)相區(qū)別的一類基因,常作為表示轉(zhuǎn)錄活性的指示分子。將報(bào)道基因與表達(dá)載體的啟動(dòng)子序列相連,并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),通過胞外信號(hào)誘導(dǎo)在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可以在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜或細(xì)胞外直接釋放信號(hào)或者催化特定的酶促反應(yīng)間接釋放信號(hào)，再通過特定的方法靈敏并且定量檢出，即檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)報(bào)道蛋白的含量或活性，從而直觀地報(bào)告細(xì)胞內(nèi)與基因表達(dá)有關(guān)的信號(hào)級(jí)聯(lián)，即報(bào)道基因技術(shù)?？稍诨虮磉_(dá)的時(shí)空調(diào)控、受體特性、藥物篩選和基因?qū)胂到y(tǒng)等研究中可廣泛應(yīng)用。理論基礎(chǔ)一、報(bào)告基因概況調(diào)控模型

報(bào)告基因種類繁多，選擇何種報(bào)告基因應(yīng)基于不同的研究目的、實(shí)驗(yàn)性質(zhì)所用細(xì)胞系、產(chǎn)物檢測(cè)的時(shí)空性和檢測(cè)方法，此外還要考慮報(bào)告基因的穩(wěn)定性、半衰期、靈敏度和線性范圍。選擇報(bào)告基因還需要考慮以下方面：1）報(bào)告基因的產(chǎn)物和蛋白活性的定量檢測(cè)方法容易建立，快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好；2）在被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中不存在報(bào)告基因產(chǎn)物或類似的內(nèi)源性物質(zhì)；3）報(bào)告基因表達(dá)率與目的基因轉(zhuǎn)錄水平同步。報(bào)告基因技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)背景活性低,而且可以將細(xì)胞表面的信號(hào)放大,產(chǎn)生一個(gè)高敏感、易檢測(cè)的反應(yīng)。類型報(bào)告基因從功能上基本可分為4類：1）以轉(zhuǎn)運(yùn)功能為主，持續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)放射性離子進(jìn)

入轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞；2）選擇性催化放射性或熒光底物發(fā)生反應(yīng)的酶蛋白；3）不添加額外底物而發(fā)出自然熒光的熒光蛋

白；4）能特異性捕獲具有放射性、磁性或熒光標(biāo)

記的配體，抗原或半抗原的錨定在膜上的受體

或抗體。從類別上，報(bào)告基因可分為1）氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶2）β-半乳糖苷酶3）熒光素酶4）分泌型堿性磷酸酶5）熒光蛋白家族

螢火蟲熒光素酶、細(xì)菌熒光素酶以及熒光蛋白家族的綠熒光蛋白是目前在報(bào)告基因光學(xué)成像中最主要的3種報(bào)告基因。二、SEAP（分泌型堿性磷酸酶）分泌型堿性磷酸酶(secretedalkalinephosphatase,SEAP)是人胎盤堿性磷酸酶(humanplacentalalkalinephosphatase,HPLAP)的突變體，也有部分來自北大西洋海域中的耐熱細(xì)菌分離而得到的耐熱型堿性磷酸酶。該酶能從表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，對(duì)其編碼產(chǎn)物的檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高，且重現(xiàn)性好，因此具有作為報(bào)道基因的優(yōu)良性質(zhì)。原理SEAP為HPLAP的突變體，缺乏羧基末端24個(gè)氨基酸，使得SEAP可全部分泌至細(xì)胞外，并無內(nèi)源表達(dá)。因此對(duì)于SEAP的檢測(cè)，無需破碎細(xì)胞，僅需用培養(yǎng)基即可檢測(cè)酶活性，便于某些實(shí)時(shí)觀測(cè)定量型的試驗(yàn)。

酶活性檢測(cè)時(shí)，1）以間硝基苯磷酸(PNPP)為底物、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、但靈敏度較低。2）以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為底物進(jìn)行比色測(cè)定，靈敏度增高。3）使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍比β半乳糖苷酶高5~6個(gè)數(shù)量級(jí)。

SEAP的應(yīng)用1.中和實(shí)驗(yàn)：原理：基于原發(fā)性免疫對(duì)病毒侵襲進(jìn)行保護(hù)。幾種中和抗體檢測(cè)方法：1）分泌型堿性磷酸酶中和法：

一種體外高通量且靈敏檢測(cè)中和抗體效價(jià)的方法。2）酶聯(lián)免疫法(ELISA)：

一種高度重復(fù)的定量體液反應(yīng)中特異性抗體的快速檢測(cè)方法。基本原理：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

傳統(tǒng)細(xì)胞病變觀察：

以50%細(xì)胞病變稀釋度為中和血清滴度的測(cè)定方法。觀察與判定細(xì)胞病變的時(shí)間，大約在3~10天間?；赟EAP的細(xì)胞病變檢測(cè)：以SEAP報(bào)道基因?yàn)榛A(chǔ)的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)5型腺病毒的中和血清滴度時(shí)，在24小時(shí)內(nèi)便可得到結(jié)果。

原因：SEAP是對(duì)侵入細(xì)胞病基因的表達(dá)產(chǎn)物做出的檢測(cè)，該產(chǎn)物在細(xì)胞生長(zhǎng)液中的出現(xiàn)是伴隨侵入病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)而出現(xiàn)的。這在時(shí)間上會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于細(xì)胞結(jié)構(gòu)因病毒擴(kuò)增而引起病變現(xiàn)象。3）細(xì)胞病變觀察2.基因工程抗體人源化與檢測(cè)

鼠源抗體人源化的原因：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用，但由于它們是異源蛋白，不能直接用于人體內(nèi)，否則會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。實(shí)例：

運(yùn)用分子間拼接技術(shù)，將COS-1細(xì)胞中鼠源I