基因工程大實(shí)驗(yàn)開題報(bào)告

PAGEPAGE5學(xué)號內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程大實(shí)驗(yàn)開題報(bào)告論文題目：納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)學(xué)生姓名：年級：專業(yè)：指導(dǎo)教師：年月日學(xué)生姓名民族性別出生年月論文題目納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)開題時(shí)間結(jié)題時(shí)間項(xiàng)目來源本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課一、立論依據(jù)“納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)”項(xiàng)目的選題和研究的意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢分析，主要參考文獻(xiàn)及出處：納豆是日本傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，日本民間有“納豆可以在一定程度上預(yù)防并治療心血管疾病”的說法。后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),納豆含有豐富的生理活性物質(zhì),具有抗血栓、降血壓、預(yù)防癌癥等多種顯著的生理調(diào)節(jié)功能,越來越受到世界各國的重視[1]。納豆激酶（nattokinase，NK）是一種枯草桿菌蛋白激酶，也是具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶。1987年由日本的須見洋行等首先發(fā)現(xiàn)，由于其具有無毒無副作用，體內(nèi)半衰期長，成本低廉等其它溶栓劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，極有可能成為新一代抗栓藥物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶能顯著地溶解體內(nèi)外血栓，明顯縮短優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間，并能激活體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維蛋白溶酶原激活劑(t-PA)，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量與作用，間接表現(xiàn)溶栓活性[3-5]。今后20年,我國將步入老齡化社會,血栓病是中老年人的高發(fā)病,是死亡威脅最大的疾病之一?，F(xiàn)在使用的溶栓藥物鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑等，在臨床使用過程中存在穩(wěn)定性差、藥效短、易引起患者全身性出血等副作用，并且有半衰期短、來源短缺、成本高等缺點(diǎn)[6-7]。而納豆激酶來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品,生產(chǎn)工藝簡單,無副作用,安全性高,符合治療血栓病的藥品或食品基料的要求。它的溶栓功效已得到各方認(rèn)可。在日本、美國、韓國和朝鮮等國家都有大公司生產(chǎn)出多種以納豆激酶為主要成分的產(chǎn)品,此外,我國在實(shí)施藥品專利保護(hù)和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)后,新藥的仿制將受到嚴(yán)格限制。因此研制新溶栓藥物具有緊迫性。雖然國內(nèi)外許多學(xué)者熱衷于納豆激酶的研究,渴望將其開發(fā)成為新一代的溶栓新藥,但目前仍存在不足之處,如還未開發(fā)出納豆激酶針劑等。而社會對高效、廉價(jià)的溶血栓類藥物的開發(fā)要求非常迫切,因此納豆激酶所具有的許多良好的生理調(diào)節(jié)功能和特殊的溶血栓活性使其成為了一種預(yù)防和治療血栓及栓塞性疾病的理想藥物,具有廣泛的開發(fā)前景[8-10]。參考文獻(xiàn)[1]SumiH,HamadaH,TsushimaH,etal.Experientia,1987,43(10):1110-1111.[2]余榕捷,謝秋玲,洪岸,等.中國病理生理雜志,2003,19(6):757-761.[3]NakamuraT,YamagataY,IchishimaE.BiosciBiotechBiochem,1992,56(11):1869-1871.[4]羅立新,黃志立,凌均建,等.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào),2002,29(4):59-62.[5]SCHUBERTM,PETERSSONUA,HAASBJ,eta.lProteomemapofthechloroplastlumenofArabidopsisthaliana[J].JBiolChem,2002,277(10):8354-8365.[6]張鋒,金杰.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,14(3):159-162.[7]LINDERMAYRC,DURNERJ.S-Nitrosylationinplants:patternandfunction[J].JProteomics,2009,73(1):1-9.[8]張淑梅,張?jiān)坪?趙云祥,等.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),1999,15(6):912-915.[9]孫立娜.工企醫(yī)刊,2008,21(2):57-60.[10]付利,楊志興.納豆激酶的研究與應(yīng)用.生物工程進(jìn)展,1995.二、實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題：1.1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：①、NK的PCR擴(kuò)增。②、PCR產(chǎn)物與pMD-19-T的連接。③、pET-trx與NK構(gòu)建表達(dá)載體。④、轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)⑤、SDS檢測并觀察。1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：①、學(xué)習(xí)如何進(jìn)行一個(gè)項(xiàng)目的前期準(zhǔn)備工作，策劃、論證等。②、通過實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)將書本知識轉(zhuǎn)化為實(shí)際操作的能力。③、培養(yǎng)良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，如記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，反思實(shí)驗(yàn)操作，解決實(shí)驗(yàn)問題。1.3擬解決的關(guān)鍵問題：①、目的基因的克隆和酶切。②、如何構(gòu)建正確的過渡和表達(dá)載體。③、如何利用SDS檢測表達(dá)蛋白。實(shí)驗(yàn)思路、方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析：2.1實(shí)驗(yàn)思路及方法PCR克隆pMD18-T-NK克隆質(zhì)粒上的納豆激酶基因，將其與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選鑒定，然后用雙酶（BamHI/EcoRI）切下相應(yīng)基因片段，插入原核表達(dá)載體pET-trx中，在表達(dá)菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)出蛋白質(zhì)，最后利用SDS鑒定。2.2實(shí)驗(yàn)方案2.2.1克隆NK基因通過PCR利用給定引物和條件克隆pMD18-T-NK中的NK基因。2.2.2表達(dá)載體的構(gòu)建將NK基因與pMD-19-T連接過夜，將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入已制備好的DH5α感受態(tài)菌中。EcoRI和BamHI雙酶切pMD-19-T-NK質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-trx，電泳回收NK片段和pET-trx載體，連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-trx-NK。將pET-trx-NK轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，抗生素篩選，提質(zhì)粒pET-trx-NK電泳鑒定。2.2.3誘導(dǎo)表達(dá)并鑒定NK基因鑒定正確后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS檢測。2.3技術(shù)路線pMD1pMD19-T-NKpET-trx擴(kuò)增NKpMD19-TBamHI/EcoRI回收片段連接pET-trx-NKIPTG誘導(dǎo)表達(dá)SDSDH5αBL21(DE3)pMD18-T-NK2.3可行性分析①、實(shí)驗(yàn)室的各類儀器完好、試劑齊全。②、實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)操作從提取質(zhì)粒到IPTG誘導(dǎo)、SDS均在課本中有所涉及且發(fā)展得十分成熟。③、師兄師姐在納豆激酶的實(shí)驗(yàn)中已有多次成功的經(jīng)驗(yàn)。④、NK基因中不含內(nèi)含子，可以在原核生物中表達(dá)。由此可見，本實(shí)驗(yàn)“納豆激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)”會取得預(yù)期的成功。3.實(shí)驗(yàn)進(jìn)度（10天之內(nèi)）：第一天下午：領(lǐng)取、查看實(shí)驗(yàn)器材，滅菌，配溶液，接種E.coliDH5α、BL21（DE3）至LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。第二天上午：制備DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌。下午：PCR擴(kuò)增NK基因，電泳檢測。晚上：擴(kuò)增的NK基因與pMD19-T連接過夜，接種E.coliPET-trx至LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜搖菌。第三天上午：pMD19-T-NK轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，搖菌，涂板，提取E.coliPET-trx質(zhì)粒。第四天上午：提取轉(zhuǎn)化了pMD19-T-NK的E.coliDH5α的質(zhì)粒，電泳檢測。下午：BamHI/EcoRI酶切pET-trx、pMD19-T-NK電泳鑒定。晚上：回收片段，連接過夜。第五天上午：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)菌，搖菌，涂板。第六天上午：選擇經(jīng)過抗生素抗性篩選的菌落，搖菌，電泳鑒定，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。第七天SDS檢測表達(dá)蛋白，觀察脫色膠，照相。4.預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果：納豆激酶能在BL21大腸桿菌中表達(dá)，且SDS檢驗(yàn)后觀察到一條代表28KD左右的帶，表示有蛋白質(zhì)的表達(dá)，且根據(jù)條帶粗細(xì)的不同可以判斷出NK表達(dá)量的多少。5.曾參與與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的學(xué)習(xí)和研究工作積累以及已取得的工作成績：（學(xué)過基因工程課程、讀過相關(guān)的文獻(xiàn)、寫過有關(guān)的綜述、參加過相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或研究課題、獲得過相關(guān)的學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)情況等）6.請運(yùn)用已學(xué)過的課堂知識結(jié)合看過