蓖麻粗毒的提取及其藥效成分和藥效研究

蓖麻粗毒的提取及其藥效成分和藥效研究

氨基乙醇鈉對(duì)所有哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞都有毒性作用，ld50為7,10）g，kg。在防治草原鼠害中具有較好的應(yīng)用前景。我們于2005～2006年對(duì)蓖麻粗毒的分離、提取及活性進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究。1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑蓖麻籽為市售,去殼后4℃保存;實(shí)驗(yàn)用昆明種小白鼠(體重20g左右)由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;勻漿機(jī)、冷凍離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、真空干燥器、1ml注射器、蒸餾水、透析袋均購(gòu)自四川大學(xué)設(shè)備處;(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4等均為國(guó)產(chǎn)分析純。2單次給藥、細(xì)注射參考Nicolson等的方法,對(duì)提取條件進(jìn)一步研究,以小鼠是否死亡為指示,尋找提取蓖麻粗毒的最優(yōu)途徑。小鼠活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):①對(duì)浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對(duì)應(yīng)的浸提液浸泡24h。分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對(duì)應(yīng)的粗毒溶液;②對(duì)鹽析后的混合物10000r/min離心30min,保留沉淀,取上清液。以上述浸提和鹽析兩種方式獲得的溶液做原藥,分別取1ml稀釋后腹腔注射小鼠(劑量為每鼠0.5ml),每組每濃度用5只小鼠,并取1只小鼠做空白對(duì)照。以小鼠死亡率最低的那組即是粗毒提取效果最佳的。每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.1實(shí)驗(yàn)a：提取物的選擇和提取物條件的討論2.1.1方法勻漿和浸提液制備分別稱(chēng)取50g脫殼蓖麻籽,依次分別用100ml的水、100ml0.2mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)和100ml5%乙酸溶液進(jìn)行勻漿,再靜置于4℃環(huán)境中浸提24h。對(duì)浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對(duì)應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對(duì)應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實(shí)驗(yàn)。合成條件2、48h分別稱(chēng)取50g脫殼蓖麻籽,用上述3種的浸提劑100ml勻漿,于4℃浸提12、24、36、48h。對(duì)浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對(duì)應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對(duì)應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實(shí)驗(yàn)。各浸提劑最佳浸提時(shí)間的確定分別稱(chēng)取50g脫殼蓖麻籽,加入100ml、150ml、200ml的上述3種的浸提劑勻漿。于4℃浸提至各種浸提劑對(duì)應(yīng)具有最佳蓖麻粗毒浸提效果的時(shí)間。對(duì)浸提后的混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂,保留清液,提取離心所剩的渣滓,每種渣滓再用對(duì)應(yīng)的浸提液浸泡24h后,分別進(jìn)行4000r/min離心30min,小心取出油脂,保留清液,得到對(duì)應(yīng)的粗毒溶液作小鼠活性實(shí)驗(yàn)。清液鹽析濃縮法分別稱(chēng)取50g脫殼蓖麻籽,各自加入適量的浸提劑勻漿,4℃浸提適宜時(shí)間。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液鹽析24h后,10000r/min離心30min,收集沉淀,沉淀溶解于蒸餾水中,透析24h,將透析所得40℃減壓蒸餾,最后真空干燥可得蓖麻粗毒。從而可計(jì)算各自的產(chǎn)率。2.1.2結(jié)果與分析緩沖液的浸提效果結(jié)果表明,0.2mol/L的磷酸緩沖液的浸提后再次浸泡提取液的殺鼠效果最低,說(shuō)明0.2mol/L的磷酸緩沖液的浸提效果最好(表1)。最佳浸提時(shí)間的確定由于選擇3種不同的浸提劑,故按照浸提劑分組,組內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最后綜合對(duì)比得出結(jié)果。同時(shí)最終只選擇3個(gè)濃度梯度的藥物做活性實(shí)驗(yàn)。顯然,水做浸提劑時(shí)浸提36h的殺鼠效果最低,說(shuō)明此時(shí)水已經(jīng)把絕大多數(shù)的蓖麻毒素浸提出來(lái),導(dǎo)致渣滓里的蓖麻毒素含量很低,所以再次浸提后的殺鼠效果最低,從而說(shuō)明36h是水的最佳浸提時(shí)間(表2);5%乙酸浸提劑浸提24h的殺鼠效果較低,浸提36h后的殺鼠效果區(qū)別很小,故24h是5%乙酸做浸提劑時(shí)的最佳時(shí)間(表3);0.2mol/L的磷酸緩沖液浸提24h的殺鼠效果較低,浸提36h后的殺鼠效果區(qū)別很小,同理,24h是0.2mol/L的磷酸緩沖液做浸提劑時(shí)的最佳時(shí)間(表4)。最佳質(zhì)量體積比的確定由于選擇3種浸提劑,故按照浸提劑分組,組內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最后綜合對(duì)比得出結(jié)果。同時(shí)基于方便的考慮,只選擇3個(gè)濃度梯度的藥物做活性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,水做浸提劑時(shí),蓖麻籽與水的質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)時(shí),再次浸泡提取液的殺鼠效果較低,說(shuō)明質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)的效果較好,同理1∶4時(shí)的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最終加入的鹽析劑就越多,而且1∶4浸提時(shí)的滅鼠效果并無(wú)顯著提高,所以出于經(jīng)濟(jì)方便的考慮,選擇1∶3為最佳質(zhì)量體積比(表5);5%乙酸做浸提劑時(shí),蓖麻籽與5%乙酸的質(zhì)量體積比為1∶2(g/ml)時(shí),再次浸提液的殺鼠效果最低,說(shuō)明質(zhì)量體積比為1∶2(g/ml)的效果最好(表6);0.2mol/L的磷酸緩沖液做浸提劑時(shí),質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)時(shí),再次浸泡提取液的殺鼠效果最低,說(shuō)明質(zhì)量體積比為1∶3(g/ml)的效果較好,同理1∶4時(shí)的效果最好,但是由于加入的浸提液越多,最終加入的鹽析劑就越多,而且1∶4浸提時(shí)的滅鼠效果并無(wú)顯著提高,出于經(jīng)濟(jì)方便的考慮,所以選擇1∶3為最佳質(zhì)量體積比(表6)。出于經(jīng)濟(jì)和方便的考慮,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),確定pH7.2左右可作為最適合浸提,在此不再討論。最佳浸提劑的確定由結(jié)果不難看出,只有0.2mol/L的磷酸緩沖液在同樣條件下所得蓖麻毒素(粗毒)產(chǎn)率最高(表8),同時(shí)提取路線還兼顧到蛋白的穩(wěn)定性及經(jīng)濟(jì)性,正是要尋找的最佳浸提劑。2.2實(shí)驗(yàn)b：鹽析劑的選擇和最佳鹽析條件的探索2.2.1不同鹽析劑對(duì)小鼠的鹽析活性實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取50g脫殼蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.2)勻漿,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液中分別加入不同的鹽析劑,每種鹽析劑分別加到50%、60%、70%、80%飽和度,鹽析24h后,10000r/min離心30min,觀察現(xiàn)象,收集沉淀,然后對(duì)所得的每種上清液取1ml,稀釋1000倍,做小鼠活性實(shí)驗(yàn),最終小鼠未死亡或死亡最少的那組即是鹽析效果最佳的。2.2.2結(jié)果與分析從表9可知,80%飽和度的(NH4)2SO4鹽析后的上清液殺鼠效果最低,說(shuō)明80%飽和度的(NH4)2SO4鹽析效果最好。2.3實(shí)驗(yàn)c：確定厚毒有用程度2.3.1ld50的制備稱(chēng)取50g脫殼蓖麻仔,加入150ml0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.2)勻漿,4℃浸提24h。所得混合物4000r/min離心30min,小心除去油脂以及離心所剩的渣滓,保留清液,在清液中加入(NH4)2SO4到80%飽和度,鹽析24h后,10000r/min離心30min,收集沉淀,然后對(duì)所得的沉淀用蒸餾水透析24h。將透析所得40℃減壓蒸餾,最后真空干燥可得粗毒。稱(chēng)取一定量的粗毒,溶于100ml水中煮沸。放涼后取1ml以10倍稀釋法配制腹腔注射用藥,做小鼠活性實(shí)驗(yàn)。用未煮沸的粗毒做活性實(shí)驗(yàn),可求得LD50。小鼠隨機(jī)分為5組,每組5只,按低比稀釋法配制不同劑量的藥液,每組分別給藥,記錄注射劑量、小鼠死亡時(shí)間,共觀察96h。LD50計(jì)算方法為寇氏法。2.3.2糖液毒蛋白的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果蓖麻粗毒制成水劑后煮沸,其中毒蛋白(含血球凝集素)被破壞,注射藥劑中有效成分僅為蓖麻堿和變應(yīng)原,蓖麻堿的毒性較弱,變應(yīng)原無(wú)致死作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出毒蛋白遭破壞后的殺鼠性能顯然比未被破壞的對(duì)照組要低得多,而血球凝集素的毒性?xún)H為蓖麻毒蛋白的1/10(表10)。從而說(shuō)明蓖麻粗毒的主要藥效成分為蓖麻毒蛋白。求得LD50=7.971μg/kg,S=0.0548μg/kgLD50的95%平均可信限為7.971±1.281μg/kg3投毒投毒試驗(yàn)2006年3月中旬,在四川省阿壩州若爾蓋縣熱爾鄉(xiāng)進(jìn)行了野外滅鼠試驗(yàn)。當(dāng)?shù)仄骄０?500m,氣溫-3～10℃。滅鼠對(duì)象主要為高原鼠兔。將蓖麻粗毒制成的滅鼠劑用水稀釋后拌取餌料,以餌料重量計(jì)配成1%濃度的毒餌,人工投餌,在5萬(wàn)畝投餌區(qū)內(nèi)隨機(jī)劃定6個(gè)半徑為28.2m的圓形樣方,樣方間隔在50m以上,并設(shè)2個(gè)清水對(duì)照。投藥前調(diào)查樣方內(nèi)的有效洞數(shù),方法為堵洞盜洞法。投毒后6天檢查有效洞數(shù),計(jì)算滅效,結(jié)果如表12。大面積實(shí)驗(yàn)的校正滅效為85.41%,實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)高原鼠兔活動(dòng)明顯減小,滅殺效果比較明顯。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)以滅鼠為目的,對(duì)蓖麻毒素(粗毒)的提取路線進(jìn)行優(yōu)化選擇,研究了提取粗毒的殺鼠活性,并進(jìn)行了大面積野外滅鼠試驗(yàn)。結(jié)果表明,使用優(yōu)選的蓖麻毒素提取方法,