雙足并趾畸形患兒的先天性并指及相關(guān)基因的分析

雙足并趾畸形患兒的先天性并指及相關(guān)基因的分析

指以異常足部發(fā)育為主要癥狀的遺傳疾病，為常染色體顯性遺傳。臨床上可分為五種類型：、、、和。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型先天性并指分別定位于2q34~36、2q31~q32和6q21~23.2。并指伴多指(synpolydactyly;SPD)為Ⅱ型并指(syndactyly,typeⅡ),通常情況下多為第3、4手指和第4、5腳趾受累,兩指(趾)間由蹼相連接,不能分離。本病與其他亞型并指(趾)的不同之處在于,可出現(xiàn)多指(趾)。膚紋檢查可見手掌紋理異常,掌褶線斷裂。目前認(rèn)為本病致病基因為HOXD13,定位于2q31-q32。在本研究中,我們對湖南懷化地區(qū)一出生后即發(fā)現(xiàn)雙手并指,雙足并趾畸形患兒的常染色體顯性遺傳先天性并指多指家系進行了連鎖分析,表明其與Ⅱ型并指基因所在的區(qū)域緊密連鎖,對HOXD13基因序列分析未發(fā)現(xiàn)突變。1材料和方法1.1病例對照及分析病例來源、家系情況病例由湖南省懷化地區(qū)衛(wèi)生學(xué)校提供,為一先天性并指多指家系。該病已在家系中傳遞了4代,先證者曾祖母為首發(fā)病例。我們對該家系中的42名成員進行了分析,其遺傳關(guān)系經(jīng)親屬確證,調(diào)查前每位成員都做到了知情同意。1.2提取的dna用酚-氯仿法從外周全血抽提基因組DNA。1.3連通性分析1.3.1溫度和時間對聚合酶活性的影響5μl反應(yīng)體系,含50ng模板DNA,2.5mol/LMgCl2,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl,每種dNTP250mmol/L,每引物0.625pmol/L,和0.25UHotstarTaqDNA聚合酶(QIANGENGmbH,Hilden,Germany)。反應(yīng)采用Perkin-Elmer9700熱循環(huán)儀。采用標(biāo)準(zhǔn)Touchdown程序:95℃預(yù)變性12min;touchdown循環(huán)14次,95℃變性30s,復(fù)性溫度由63℃起始,以后每個循環(huán)遞減0.5℃,直到56℃,72℃延伸90s;之后保持復(fù)性溫度為56℃,1min,再進行30個循環(huán);最后產(chǎn)物72℃延伸10min。1.3.2雙核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記ABI公司連鎖圖譜2.0版。本套熒光標(biāo)記物為400個從Ge′ne′thon人類遺傳圖譜中選擇的多態(tài)性雙核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記。每對標(biāo)記物間距為10cM。1.3.3胺凝膠電泳用ABI377DNA測序儀進行5%聚丙烯酰胺凝膠電泳,連鎖分析應(yīng)用LINKAGE軟件(Version5.10),外顯率95%,疾病基因頻率設(shè)為0.001。男女兩性重組率相等。1.4突變檢測1.4.1寡核苷酸體外擴增作為摸板的基因組DNA來自Ⅱ-10及Ⅲ-16和兩名正常對照Ⅲ-14、Ⅲ-15。使用5對合成的寡核苷酸引物,對目的基因的兩個外顯子及其相鄰內(nèi)含子序列進行體外擴增。總反應(yīng)體積為35μl,采用標(biāo)準(zhǔn)Touchdown程序(同上)。1.4.2pcr產(chǎn)物的測量序列PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用ABIBig-DyeVer2.0試劑盒進行循環(huán)測序反應(yīng),利用ABI377型DNA測序儀分析。2雙側(cè)對稱畸形家系中有16名成員患病。先證者Ⅳ-5,女,2歲?；純撼錾蠹窗l(fā)現(xiàn)雙手并指,雙足并趾畸形。X線顯示雙手3/4指并指,雙足4/5趾并趾,指(趾)間由軟組織相連。并指均呈雙側(cè)對稱畸形。部分患者同時出現(xiàn)雙手4/5指并指,或雙足小趾多趾(圖1)。兩點連鎖分析在Ⅱ型并指基因座2q31~q32發(fā)現(xiàn)緊密連鎖(表1)。在D2s2314和D2s2310兩引物處最大兩點間LOD值為6.78。多點連鎖分析最大LOD值為7.02。本家系單倍型分析遺傳區(qū)間從D2s2302到D2s315之間,間距為20.61cM(圖2)。HOXD13基因位于連鎖區(qū)間之內(nèi)。序列分析在HOXD13基因編碼區(qū)、內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)域,或啟動子區(qū)域未發(fā)現(xiàn)突變。3hoxd基因重組并指伴多指(Synpolydactyly;SPD)是一種罕見的常染色體顯性致病基因引起的肢體發(fā)育異常。該型并指(趾)畸形表現(xiàn)為手部3、4指的并指,通常伴蹼中第4指的全部或部分多指畸形,足部第4、5趾并趾及第5趾的多趾畸形。臨床上有手部畸形的患者常伴有異常的掌紋。1927年,Thomsen對本病進行了詳細(xì)的描述,隨后相繼發(fā)現(xiàn)了一系列患有并指(趾)的大家系。其中最重要的是1995年Sayli在土耳其發(fā)現(xiàn)的一個完整的大家系。該家系共有7代,其中病人182人,這顯然是由于奠基者效應(yīng)所引起的。同年Akarsu詳細(xì)描述了這一罕見的大家系的臨床表現(xiàn)。通過對這一罕見家系的遺傳學(xué)研究,Sarfarazi將SPD遺傳基因座定位于2q31,間距為1.7cM。這一結(jié)果提示HOXD同源基因簇中的基因突變有可能是導(dǎo)致SPD的原因。其中發(fā)生在HOXD8基因處的重組排除了基因簇中3′端方向基因致病的可能性,5′端方向的基因,特別是HOXD13、EVX2、DLX2、DLX1則很有可能是本病的致病基因。隨后,在其他家系中的工作進一步證實了這一遺傳基因座。1996年,Akarsu對Sayli報道的家系的遺傳學(xué)分析,在HOXD13基因產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一24個多聚丙氨酸的重復(fù)。正常人的HOXD13基因在翻譯起始位點下游145bp處,編碼一段15個丙氨酸的肽段,而在純合子病人中由于堿基的插入,這一肽段延長達24個丙氨酸。之后,在其他的家系中也在HOXD13基因中發(fā)現(xiàn)了9個多聚丙氨酸的插入,證實了HOXD13基因的突變是導(dǎo)致Ⅱ型并指的原因之一。HOXD基因是由13個同源基因構(gòu)成的一同源基因簇,它屬于同源異型基因簇(Hoxgenecluster)中的一種。Hox基因簇在發(fā)育上十分古老,動物發(fā)育過程中它對肢體形態(tài)的形成有著重要的調(diào)節(jié)作用。Hox基因簇編碼一系列轉(zhuǎn)錄因子,在發(fā)育中將不同的定位信息傳送到肌體不同部位,使得肌體各部位能夠各自獨立而又協(xié)調(diào)地發(fā)展。HOXD基因簇中的9個同源基因(HOXD1,-D3,-D4,-D8,-D9,-D10,-D11,-D12,-D13)根據(jù)其距著絲粒的遠近,按由遠到近的順序在染色體上依次排列。其上游近著絲粒方向,依次排列著EVX2基因和7個保守的調(diào)控元件。Kmita通過定位重組的方法,對小鼠體內(nèi)HOXD基因簇中的基因和其上游的調(diào)控元件分別進行敲除和重復(fù),然后各自表達,觀察不同基因?qū)π∈笾w發(fā)育的影響。結(jié)果顯示,HOXD基因簇中不同基因或其上游調(diào)控因子的重復(fù)或缺失都可能影響手指關(guān)節(jié)的發(fā)育,從而造成指(趾)數(shù)目或形態(tài)的異常。Kmita認(rèn)為其原因可能是因為,在HOXD基因簇的遠端有一增強子,這一遠端增強子對HOXD基因存在增強作用,但HOXD同源基因之間對這種增強作用存在競爭性抑制,使得遠端增強子的增強作用具有極性效應(yīng),越靠近5′端增強子作用越明顯,從5′端向3′端增強子作用逐漸減弱。此前Goodman也曾發(fā)現(xiàn)一SPD家系中出現(xiàn)一117kb的染色體片段缺失。該缺失的片段