正畸牙髓中降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化

正畸牙髓中降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化

鈣基因（csi）的相關(guān)概念是1982年人類對(duì)鈣含量變化的基因結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)。除了能將感覺信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)外,還具有擴(kuò)張血管、漿液外滲、影響巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞的功能等外周生理調(diào)節(jié)作用。文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)在正畸加力過程中牙周CGRP神經(jīng)發(fā)生了明顯的變化,但在正畸過程中,尤其是撤力后牙髓CGRP神經(jīng)纖維發(fā)生了怎樣的變化,目前還不很清楚。本研究采用免疫熒光染色觀察牙齒移動(dòng)過程中大鼠牙髓組織CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化情況,了解牙髓CGRP與正畸之間的關(guān)系。1材料和方法1.1下頜加力教育SD雄性大鼠,體質(zhì)量(180±20)g。加力裝置采用結(jié)扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端結(jié)扎在上頜第一磨牙上,另一端結(jié)扎在上頜中切牙上,并用自凝塑料加固結(jié)扎絲與牙連接處。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(放置加力裝置但不加力)和牙齒移動(dòng)組。牙齒移動(dòng)組加力力值為0.49N(50g),使磨牙向近中移動(dòng)。牙齒移動(dòng)組根據(jù)不同時(shí)間分為以下幾個(gè)亞組:加力3d組、加力7d組、加力14d組、撤力后7d組、撤力后14d組、撤力后28d組,正常對(duì)照組及牙齒移動(dòng)每個(gè)亞組均為6只大鼠。1.2脫頜骨的制備達(dá)規(guī)定時(shí)間點(diǎn)后,全麻下打開大鼠胸腔,暴露心臟,剪開右心房放出血液,再剪開左心室將輸液管從左心室插入主動(dòng)脈用動(dòng)脈夾固定,先用80～100ml生理鹽水將血管內(nèi)的血液沖洗干凈,再注入含40g/L多聚甲醛的0.1mol/LPBS固定液400ml灌流固定1.5h,并用上述固定液后固定2h。由口腔內(nèi)切開上頜骨周圍軟組織,剪斷雙側(cè)顴突,取出上頜骨。去除骨表面軟組織,置100g/LEDTA液中脫鈣2～3周。將脫鈣的上頜骨入300g/L蔗糖24h、4℃至組織沉底。沿近遠(yuǎn)中方向縱行切片,片厚25μm。1.3熒光封片觀察300ml/L的過氧化氫液1份+純甲醇50份混合,室溫下處理30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶;滴加正常血清封閉液(為二抗同種動(dòng)物血清,用于組織切片的封閉),室溫20min;滴加兔抗CGRP(1∶2000,Sigma公司,美國(guó))),4℃,過夜。加入熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200,Sigma公司,美國(guó)),37℃孵育1h。切片經(jīng)0.01mol/LPBS充分漂洗,用熒光封片劑封片。OlympusBX-60顯微鏡下觀察。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)采用PBS替代一抗,其余過程同上。1.4免疫熒光檢測(cè)各組標(biāo)本(5個(gè)標(biāo)本/組)取相同數(shù)量的牙切片(5張/標(biāo)本)作免疫熒光染色,切片在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并統(tǒng)計(jì)各組切片中CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維的數(shù)目。以根/標(biāo)本表示。各組間通過t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性比較。2正畸牙移動(dòng)過程中內(nèi)鏡下cdrp陽(yáng)性神經(jīng)纖維的變化免疫熒光染色結(jié)果顯示,正常大鼠第一磨牙牙髓組織中含有豐富的CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維。在大鼠磨牙根髓中CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維呈粗大束狀,多沿血管分布(圖1);神經(jīng)纖維經(jīng)根髓直達(dá)冠髓,進(jìn)入冠髓后逐漸分散呈條索狀,念珠樣,常沿血管分布;神經(jīng)纖維在髓頂成牙本質(zhì)細(xì)胞下層,排列成網(wǎng)狀,大量的CGRP陽(yáng)性纖維從網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分出垂直進(jìn)入成牙本質(zhì)細(xì)胞層及牙本質(zhì)層內(nèi)(圖2)。牙頸部及牙根部較少見到成牙本質(zhì)細(xì)胞下CGRP陽(yáng)性纖維的網(wǎng)狀分布。正畸牙齒移動(dòng)過程中大鼠牙髓組織中CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維發(fā)生了明顯的變化,并具有一定的規(guī)律性。加力后3d大鼠牙髓CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量開始增加[(17.57±4.22)根/標(biāo)本],與對(duì)照組[(8.03±4.49)根/標(biāo)本]相比P<0.05(圖3);加力7d達(dá)到最高(24.04±3.55)根/標(biāo)本,加力14d達(dá)到(21±4.11)根/標(biāo)本,與對(duì)照組相比P<0.01(圖4);撤力后7d陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量為19.23±5.23,增加現(xiàn)象一直持續(xù)到撤力后14d[(18.23±5.08)根/標(biāo)本],與對(duì)照組相比P<0.05;至撤力后28d下降到正常水平[(8.12±5.01)根/標(biāo)本]。3正畸時(shí)間中牙髓內(nèi)內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡內(nèi)鏡外作用情況牙髓組織及牙周組織中的CGRP是由三叉神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元的胞體合成,然后以快速軸漿運(yùn)輸?shù)男问椒謩e運(yùn)輸?shù)狡渲袠卸撕屯庵芏?。其中樞端作為感覺神經(jīng)元的傳入纖維,主要負(fù)責(zé)痛覺、溫覺的傳導(dǎo)。在外周,牙髓神經(jīng)末梢在牙齒受到傷害性刺激時(shí)會(huì)傳出釋放CGRP參與牙髓組織的炎癥、免疫及修復(fù)反應(yīng)。本研究觀察到在正常的大鼠組織中,CGRP在髓頂成牙本質(zhì)細(xì)胞下層,排列成網(wǎng)狀,并有大量的CGRP陽(yáng)性纖維從網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分出垂直進(jìn)入成牙本質(zhì)細(xì)胞層及牙本質(zhì)層內(nèi),提示可能與牙齒的傷害性感受有關(guān)。冠髓和根髓內(nèi)CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維多沿血管分布,提示可能與調(diào)節(jié)牙髓血管功能有關(guān)。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也已經(jīng)證實(shí)CGRP可以影響牙髓神經(jīng)末梢的感受性以及牙髓組織血管的擴(kuò)張和漿液滲出。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察到CGRP還能夠直接作用于牙髓靶細(xì)胞,調(diào)節(jié)其生理功能。另有研究發(fā)現(xiàn)正畸牙齒移動(dòng)能夠使牙髓血流量明顯增加,但CGRP樣神經(jīng)是否參與了該反應(yīng)過程以及與正畸牙髓組織反應(yīng)之間的確切關(guān)系還不清楚。正畸牙齒移動(dòng)過程中牙周組織CGRP樣神經(jīng)纖維的增加已經(jīng)得到證實(shí)。針對(duì)正畸牙齒移動(dòng)過程中牙髓CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維的反應(yīng),我們進(jìn)行了觀察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠牙髓組織CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維在這一過程中發(fā)生了明顯的變化,并具有一定的規(guī)律性。加力后3d大鼠冠髓和根髓CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量開始增加;加力7d達(dá)到最高;至撤力后28d開始下降,但其數(shù)量仍然明顯高于對(duì)照組。這與Kvinnsland等的結(jié)果一致,但他們只觀察加力過程中而并未涉及到撤力后牙齒穩(wěn)定期的牙髓CGRP神經(jīng)纖維的變化。Norevall等采用頰向移動(dòng)大鼠牙齒,觀察到撤力后28dCGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量和染色強(qiáng)度仍然明顯高于正常對(duì)照組。但比較以往的研究結(jié)果來看,不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)象、加力方式及觀測(cè)手段都可能影響