細(xì)菌及細(xì)菌類疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷-動(dòng)物細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法（動(dòng)物微生物技術(shù)課件）

動(dòng)物微生物應(yīng)用技術(shù)動(dòng)物細(xì)菌病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法

初診：根據(jù)流行病學(xué)、癥狀、病變等方面的疾病特征，做出初步診斷。通過實(shí)驗(yàn)室診斷，確定病原是否是細(xì)菌以及病原菌的類型。實(shí)驗(yàn)室診斷是在臨床診斷的基礎(chǔ)上進(jìn)行的病料的采集、保存和運(yùn)送細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查——涂片鏡檢細(xì)菌的分離培養(yǎng)生化檢測(cè)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)分子生物學(xué)技術(shù)基本程序一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢標(biāo)本采集的一般原則無菌采集，應(yīng)無污染，嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。注意在不同病程采集不同部位標(biāo)本，采集量不應(yīng)過少。。病程早期、急性期或癥狀典型時(shí)，使用抗生素前。采集的標(biāo)本必須新鮮，采集后盡快送檢。送檢過程中，多數(shù)菌冷藏運(yùn)輸。采集標(biāo)本時(shí)要防止傳播和自身感染。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢防止污染動(dòng)物剖檢個(gè)人防護(hù)和消毒動(dòng)物尸體處理廢棄物處理一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢動(dòng)物剖檢剖檢場(chǎng)所：應(yīng)選擇便于消毒、不滲水的解剖地點(diǎn)，最好有專門的剖檢場(chǎng)所和剖檢臺(tái)。剖檢前，動(dòng)物尸體應(yīng)浸泡消毒。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢個(gè)體防護(hù)和消毒做好個(gè)人防護(hù)：剖檢過程中，注意個(gè)人防護(hù)。剖檢后的器械浸泡消毒后洗刷。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢動(dòng)物尸體的處理動(dòng)物尸體焚燒爐深埋（投入消毒藥）焚燒或深埋：剖檢后動(dòng)物尸體和病料焚燒滅菌或消毒深埋。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢廢棄物的處理垃圾直接洗刷處理不當(dāng)會(huì)引起人和動(dòng)物疫病的散播動(dòng)物或人的傳染病一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢無菌采樣目的防止病料被污染方法所用器械和器皿必須滅菌點(diǎn)燃酒精燈注意無菌操作一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢適時(shí)采樣細(xì)菌豐富增殖時(shí)期、病料應(yīng)該新鮮：取瀕死動(dòng)物或剛死亡的動(dòng)物。死亡動(dòng)物采集病料夏天不宜遲于6～8h，冬天不遲于24h。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢適當(dāng)部位選擇病料的部位可采用兩個(gè)原則第一原則：根據(jù)疾病的類型和表現(xiàn)采集病變最典型的部位第二原則：一般采集正常無菌的部位一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢實(shí)質(zhì)臟器的采集剖開體腔后，立即采集，置于無菌容器內(nèi)。污染或剖開過久的被檢器官：先燒烙表面，然后在燒烙的深部取一塊實(shí)質(zhì)臟器，放在滅菌容器內(nèi)。如有細(xì)菌檢驗(yàn)條件，可在剖檢后直接做病料的觸片染色和細(xì)菌的分離培養(yǎng)。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢液體病料的采集膿汁、胸水一般用滅菌的棉棒或吸管吸取放入試管內(nèi)，塞好棉塞送檢。血液可無菌操作從靜脈或心臟采血，然后加抗凝劑（每1ml血液加3.8%枸櫞酸鈉0.1ml）。若需分離血清，則采血后放在滅菌的容器中，擺成斜面，待血液凝固析出血清后，再將血清吸出，置于另一滅菌試管中送檢。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢其他病料的采集皮膚要取有病變且?guī)в幸徊糠终Ｆつw的部位。被毛或羽毛取病變明顯部位，并帶毛根放平皿。胎兒可將流產(chǎn)胎兒送往實(shí)驗(yàn)室，也可用吸管或注射器吸取胎兒胃內(nèi)容物放入試管送檢。腸道及內(nèi)容物需選擇病變最明顯的部分，將其中內(nèi)容物去掉，用滅菌水輕輕沖洗后放平皿內(nèi)。一、細(xì)菌性病料的采集、保存與送檢細(xì)菌性病料的保存和送檢低溫保存盡快送檢做好記錄畜主姓名、動(dòng)物種類、地址、發(fā)病情況、欲檢部位及檢驗(yàn)項(xiàng)目、采集時(shí)間等。二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢方法光學(xué)顯微鏡檢查電子顯微鏡檢查意義觀察病料中有無細(xì)菌以及細(xì)菌的形態(tài)、數(shù)量、分布、結(jié)構(gòu)、種類等，進(jìn)行初步判斷普通光學(xué)顯微鏡用油鏡放大1000倍，一般細(xì)菌均能清楚看到。熒光顯微鏡可看到發(fā)射熒光的細(xì)菌。還應(yīng)用于免疫熒光技術(shù)中。電子顯微鏡有透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。前者適于觀察細(xì)菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，后者適于對(duì)細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的觀察。二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢不染色細(xì)菌標(biāo)本檢查1.主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況?？蓪?duì)某些病原菌作出初步鑒定，如霍亂菌。2.螺旋體由于不易著色并有形態(tài)特征，故多用不染色標(biāo)本作暗視野顯微鏡檢查。二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢常用染料分為堿性、酸性、復(fù)合染料：堿性染料電離后顯色離子帶正電荷，易與帶負(fù)電荷的被染物結(jié)合。由于細(xì)菌均帶負(fù)電荷，易與染料結(jié)合而著色。常用的有堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)等。細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢酸性染料電離后顯色離子帶負(fù)電荷，易與帶正電荷的被染物結(jié)合。細(xì)菌都帶有負(fù)電荷故不易著色。通常用來染細(xì)胞漿，而很少用于細(xì)菌的染色。常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。常用染料細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢復(fù)合染料(中性染料)及熒光染料復(fù)合染料是堿性染料和酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料(伊紅美藍(lán))、姬姆薩染料(伊紅天青)等；熒光染料如熒光標(biāo)記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。這些染色常用于某些特殊的染色技術(shù)中。常用染料細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢

革蘭染色抗酸染色熒光染色常用染色方法細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢革蘭染色最經(jīng)典、最常用的染色方法。在分離培養(yǎng)前都要進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。分為G+菌和G-菌，可初步識(shí)別和鑒定。結(jié)果為臨床早期診斷及治療提供依據(jù)?？蔀榕R床選擇用藥提供參考，有針對(duì)性的治療方案。常用染色方法細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢抗酸染色將細(xì)菌分為抗酸性和非抗酸性細(xì)菌兩大類。只用于結(jié)核病等檢查。抗酸染色的鑒定結(jié)果，對(duì)疾病的診斷和治療具有重要參考價(jià)值。常用染色方法細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價(jià)值。主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及志賀菌等的檢測(cè)。還有：鞭毛染色可觀察有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中很重要。異染顆粒染色鏡檢異染顆粒，為臨床早期診斷白喉提供依據(jù)。熒光染色常用染色方法細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查—鏡檢絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件下可以生長(zhǎng)，細(xì)菌感染性患畜標(biāo)本只有經(jīng)過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，才可對(duì)感染性疾病進(jìn)行病原學(xué)診斷并指導(dǎo)臨床用藥。因此，細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要的作用。二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)（一）細(xì)菌室的符合條件細(xì)菌室必須安裝嚴(yán)密的門窗，以防室內(nèi)環(huán)境受到外界的污染。且室內(nèi)禁用風(fēng)扇，避免細(xì)菌的播散。細(xì)菌室必須安裝供空氣消毒的紫外線燈，置于操作臺(tái)上面1m處，每天開始工作前照射20min。對(duì)其消毒效果要定期檢查，及時(shí)更換失效的燈管。二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)室內(nèi)應(yīng)備有消毒劑，用于試驗(yàn)中發(fā)生菌液灑濺時(shí)的及時(shí)消毒處理。同時(shí)還應(yīng)備有供工作人員浸手用的盛有消毒劑的水盆、肥皂及自來水源等。室內(nèi)操作臺(tái)須每日用消毒劑擦洗，地面至少一周用消毒劑擦洗1次。（一）細(xì)菌室的符合條件二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)對(duì)接收的標(biāo)本、無菌器具、用過的物品等應(yīng)明顯分開井放在指定位置。同時(shí)要對(duì)用過的物品及時(shí)進(jìn)行滅菌處理。細(xì)菌室應(yīng)有當(dāng)?shù)氐臍鉁靥攸c(diǎn)的消防設(shè)備。（一）細(xì)菌室的符合條件二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)（二）無菌實(shí)驗(yàn)室（三）基本設(shè)備和器具二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)

培養(yǎng)基的組成成分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖類；(5)血液；(6)無機(jī)鹽類；(7)雞蛋和動(dòng)物血清；(8)生長(zhǎng)因子：提供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的氮源和碳源，還有生長(zhǎng)因子。凝固物質(zhì)：制備固體培養(yǎng)基時(shí)，加入瓊脂，瓊脂是半乳糖膠，98℃以上時(shí)可溶于水，在45℃以下則凝固成凝膠狀態(tài)。抑制劑和指示劑：用于選擇、鑒定及判斷結(jié)果。二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法：用分區(qū)劃線法在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)意義看培養(yǎng)基中有無細(xì)菌生長(zhǎng)推斷是否為細(xì)菌病；依據(jù)菌落的特征判斷細(xì)菌種類；用菌落中的細(xì)菌進(jìn)一步作形態(tài)學(xué)鑒定；可進(jìn)一步作生化鑒定、血清學(xué)鑒定及動(dòng)物試驗(yàn)；可進(jìn)一步作藥敏試驗(yàn)；二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)通常選用適合目標(biāo)菌生長(zhǎng)的平板培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。不同細(xì)菌的菌落大小、形態(tài)、色澤、表面特征、邊緣狀態(tài)、隆起度、透明度等特征不同。有的細(xì)菌在鮮血瓊脂平板上形成溶血環(huán)。也可采用選擇培養(yǎng)基或鑒別培養(yǎng)基，以起到抑制雜菌或快速鑒別的效果。比如腸道桿菌科可選擇麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂。二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)分區(qū)劃線法二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上大腸桿菌菌落不同的培養(yǎng)方法需氧培養(yǎng)法：最常用的培養(yǎng)方法，適于需氧和兼性厭氧菌的培養(yǎng)。二氧化碳培養(yǎng)法：二氧化碳培養(yǎng)箱：是一臺(tái)特制的培養(yǎng)箱，既能調(diào)節(jié)C02的含量，又能調(diào)節(jié)所需的溫度。此法適于大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。燭缸法：將已接種好的培養(yǎng)基置干燥器內(nèi)，并放人點(diǎn)燃的蠟燭。干燥器蓋的邊緣涂亡凡士林，蓋上蓋子，燭光經(jīng)幾分鐘后自行熄滅，此時(shí)干燥器內(nèi)C02含量約占5％-10％，然后將干燥器放入35℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)。二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)化學(xué)法：按每升容積加入碳酸氫鈉0.4g和濃鹽酸0.35ml的比例，分別置于容器內(nèi)。將容器連同接種好的培養(yǎng)基都放人干燥器內(nèi)，蓋緊干燥器的蓋子，傾斜容器使?jié)恹}酸與碳酸氫鈉接觸生成CO2。(三)厭氧培養(yǎng)法不同的培養(yǎng)方法二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)三、細(xì)菌的生化檢測(cè)進(jìn)行生化試驗(yàn)的細(xì)菌必須是純培養(yǎng)物。檢驗(yàn)時(shí)，根據(jù)可疑細(xì)菌的生化特性選擇特定的一組生化試驗(yàn)，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，以確定病原菌的種類。例：不同種沙門氏菌的生化鑒定三、細(xì)菌的生化檢測(cè)雞白痢沙門氏菌雞傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌不同種沙門氏菌的生化鑒定糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)VP試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)IMViC試驗(yàn)大腸桿菌產(chǎn)氣桿菌三、細(xì)菌的生化檢測(cè)四、細(xì)菌的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)臨床診斷中，可用于細(xì)菌的血清分型、快速診斷或大群檢疫。用已知抗體檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的病原菌用已知的病原菌抗原檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體例：雞白痢的檢疫四、細(xì)菌的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)1、加一滴抗原2、加一滴雞的全血3、將抗原和血液混勻4、靜置2min,觀察結(jié)果雞白痢檢疫—