考馬斯亮藍(lán)測定蛋白含量總結(jié)

原理考馬斯亮藍(lán)G—250(GooMAssIeBrIllIAnTBlueG—250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G—250在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nM，后者在595nM。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(1?100ug)，蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nM波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G—250結(jié)合在2Min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1H內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)快速靈敏(靈敏度比FolIn—酚法還高4倍)、易于操作、干擾物質(zhì)少(考馬斯亮藍(lán)G—250和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，受蛋白質(zhì)的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度差異不大)，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。但此方法也存在其缺點,考馬斯亮藍(lán)在蛋白質(zhì)含量很高時線性關(guān)系偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有差異?？捡R斯亮藍(lán)G-250試劑呈色反應(yīng)顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測試蛋白質(zhì)量在1ug左右。二試劑配置三步驟1破碎細(xì)菌提取蛋白液大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在超聲破碎的時候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些細(xì)菌同樣起作用，比如鏈霉菌。(30%TritonX-100的配制TritonX-10028.2ml0.1mol/LPBS(pH=7.3)或0.05mol/lTBS(pH=7.4)72.8ml配制方法取TritonX-100及PBS(或TBS)混合，置37°C?40°C水浴中2?3h,使其充分溶解混勻。用前取該儲備液稀釋至所需濃度。通常將30%稀釋到1%。)注意：在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴,400w，破2s停1s,但是不一會就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，最后都是破碎不完全，，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中。1*會產(chǎn)生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭一定要接近底部，約1cm(我一般是距底部0.5mm）。功率根據(jù)儀器不同會有所不同，但你可以觀察液面，有波動但不要太劇烈就好。2*破3S停10S,破個二三十次看看。3*變幅桿位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。在破碎時試著加大體積，強(qiáng)度最好不要超過60%.4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說，你的方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，最好停頓時間稍長一些，這種情況多見于包涵體形式的蛋白。鏈霉菌（放線菌）超聲破碎的，用的方法條件是什么？前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時采用的具體條件是：（1）取細(xì)菌的24h培養(yǎng)液于5000r/min下離心5min收集菌體.（2） 用pH7.5的Na2HPO-NaH2PO緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液.置于40mL大塑料試管內(nèi).（3） 將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎（功率200W,1/2”探頭，破碎30s，間歇30S）.（4）破碎液于12000r/min下高速冷凍離心30min,收集細(xì)胞碎片和上清夜.超聲破菌流程與上述基本一致，就是洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris—HC1,洗滌一次就可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400—600w,超5s,停5s,冰浴，要加終濃度1mM的PMSF。為確定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù)，有必要隨時鏡檢觀察菌體是否完全破碎。在做大腸桿菌超聲時，采用的是400W，超5停5的方法，效果不錯，但是用在鏈霉菌上，似乎沒什么效果。會不會就是由于細(xì)胞壁組成差異造成的呢，因為大腸桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。再有鏡檢是檢驗破碎效果,但是細(xì)胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關(guān)系嗎？破碎時間長也會影響到酶的活性。所以想問問anaisai戰(zhàn)友，你提供的“功率200W,1/2”探頭，破碎30s,間歇30S”的條件好像是用于破碎鏈霉菌抱子的，如果你需要的是胞內(nèi)酶，細(xì)胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關(guān)系。破碎時間長的確會影響到酶的活性。這就需要在最佳的破碎時間和酶活性之間做出判斷，最直接的辦法是先繪制相關(guān)曲線（酶活性和時間的關(guān)系曲線）。實驗中，破碎的是棒狀桿菌（也是很難破壁的G+菌），破碎時間控制在30min左右，酶活較好。如果是基質(zhì)菌絲的話，好可以考慮用溶菌酶處理一下.一般來講這幾種方法讀可以的:一,液氮研磨二,用frenchpress破碎三，超聲波破碎四，溶菌酶處理預(yù)處理超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，它既是一種波動形式,又是一種能量形式。超聲對細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動，使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱（42—43°C）。空化效應(yīng)是在超聲照射下，生物體內(nèi)形成空泡，隨著空泡震動和其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機(jī)械剪切壓力和動蕩。另外，空化泡破裂時產(chǎn)生瞬時高溫（約5000C）、高壓（可達(dá)500X104Pa）,可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應(yīng)可導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞殺傷。機(jī)械效應(yīng)是超聲的原發(fā)效應(yīng)，超聲波在傳播過程中介質(zhì)質(zhì)點交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。損傷作用的強(qiáng)弱與超聲的頻率和強(qiáng)度密切相關(guān)。化學(xué)裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀。此法的裂解效果不錯的加尿素裂解液（尿素8mol/L,NaCl0.5mol/L,Tris20mmol/L,EDTA20mmol/L,2%SDS,PH值8.0）,據(jù)說效果可以。畢氏酵母細(xì)胞破碎法在破碎遇到的問題是菌體濃度太低,OD620nm在4-6之間。細(xì)胞破碎儀的最低破碎體積為4ml左右，這樣再稀釋一倍，OD就到2-3啦，我們懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測定時會測不準(zhǔn)。所以請教大家細(xì)胞破碎時最低的菌濃多少為下限？我們的菌是一種棒桿菌。破碎后，你可將液體放入透析袋中濃縮。我們所做的方法是按照1：20的比例將離心后的菌體(e.coli)溶解于超聲緩沖液(50mM磷酸pH8.0)300w10s/10s破碎20分鐘。［做了鏡檢！基本全被破碎了！我做蛋白純化的，做的包涵體。實驗中我們的菌體濃度相對獨立，與培養(yǎng)液中的菌體od無關(guān)，不收其限制，便于操作者調(diào)控。一般按每g濕菌體加5-10ml裂菌緩沖液。超聲肯定會產(chǎn)熱，所以一定要有降溫裝置，除非你需要得成分耐高溫。(基本原理超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)是利用超聲波在液體中的分散效應(yīng)，使液體產(chǎn)生空化的作用，從而使液體中的固體顆?；蚣?xì)胞組織破碎。超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)由超聲波發(fā)生器和換能器二大部分組成。超聲波發(fā)生器將市電轉(zhuǎn)變成18-21KHZ交變電能供給換能器。鋯鈦酸鋇壓電振子是換能器的心臟，它隨交變電壓以18-21KHZ頻率作伸縮彈性形變，換能器隨之作縱向機(jī)械振動。振動波通過浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應(yīng)，激發(fā)介質(zhì)里的生物微粒劇烈振動。主要用途超聲波粉碎機(jī)能用于粉碎動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、細(xì)菌、牙孢或組織。分散稀土和各類無機(jī)礦物粉。超聲波粉碎機(jī)是加速化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)的反應(yīng)速度和加速液體脫氣的理想裝置。超聲波粉碎機(jī)能配制近乎微米的百分之一大小的乳膠體；勻化“難混溶”的混合液；聚合一些物質(zhì)，析出另一些物質(zhì)?？傊?，超聲波粉碎機(jī)能實現(xiàn)提取、粉碎、乳化、勻化、懸浮液、變異、氣懸體、加速脫溶、晶化及在電子顯微鏡下配制各種生物樣本之多種功能)2考馬斯亮藍(lán)測定吸取樣品提取液1.0ml(樣品提取見LoWry法)，放入具塞試管中(每個樣品設(shè)置兩個重復(fù))，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。一般被測樣品的A595nm值在0.1—0.5之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以稀