蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定p4概述課件

第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定(p114)

第一節(jié)概述蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的P、Cu、Fe、I等。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%~13%總熱量來(lái)自蛋白質(zhì)。無(wú)論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。動(dòng)物蛋白和豆類蛋白是優(yōu)良的蛋白質(zhì)資源。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。第八章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定(p114)

第一節(jié)概述1氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中20種，二在構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠食品供給，故被稱為必須氨基酸。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量；另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，構(gòu)成2食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，最常用的方法是凱氏定氮法：它是測(cè)定總有機(jī)氮的最準(zhǔn)確和操作較簡(jiǎn)便的方法之一。該法是通過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測(cè)）。目前，測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸含量的方法很多，如：雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法等。國(guó)外：紅外分析儀。氨基酸總量：酸堿滴定法測(cè)定。各種氨基酸的分離與定量——色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，最3第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)（一）氨基黑法：氨基黑10B是酸性染料，其磺基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。①經(jīng)點(diǎn)樣后的層析紙經(jīng)電泳或?qū)游龊?，浸入氨基?0B乙酸甲醇溶液中染色10min，染色后，用10％乙酸甲醇溶液洗滌5-7次，待背景變成淺藍(lán)色后干燥。若欲進(jìn)行洗脫，用0.1mol/L氫氧化鈉浸泡30min，于595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。氨基黑10B乙酸甲醇溶液：13g氨基黑10B溶解于100ml冰乙酸和900ml甲醇中，充分搖勻，放置過(guò)夜，過(guò)濾后可反復(fù)使用幾次。②聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色：③凝膠薄層的直接染色：本法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，缺點(diǎn)是花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不同蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度不同。第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)4（二）溴酚藍(lán)法：經(jīng)電泳或?qū)游龊鬄V紙或凝膠于0.1％溴酚藍(lán)固定染色液（1g溴酚藍(lán)，100g氯化汞溶于50％乙醇水溶液中，用50％乙醇稀釋至1000ml）中浸泡15－20min，在30％乙醇：5％乙酸水溶液中漂洗過(guò)夜。如欲洗脫，可用0.1mol/L氫氧化鈉。此法缺點(diǎn)是靈敏度低，某些低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)可能染不上色。（二）溴酚藍(lán)法：5（三）考馬斯亮藍(lán)法：該染料和蛋白質(zhì)是通過(guò)范得華力結(jié)合的?？捡R斯亮藍(lán)含有較多的疏水基團(tuán)，和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)有較大的親和力，而和凝膠基質(zhì)的親和力不如氨基黑，所以用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)漂洗較容易。①經(jīng)電泳后濾紙或乙酸纖維膜在200g/L磺基水楊酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L考馬斯亮藍(lán)R250染色液中浸5min，在蒸餾水或7％乙酸中洗四次，每次5min，于90℃放置15min。②聚丙烯酰胺凝膠處理：凝膠用10％三氯乙酸固定，在10％三氯乙酸－1％考馬斯亮藍(lán)R250（19＋1）中室溫染色0.5h，用10％三氯乙酸脫底色?？捡R斯亮藍(lán)靈敏度比氨基黑高5倍，尤其適用于SDS電泳的微量蛋白質(zhì)的染色。在549nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在1-10μg呈線性關(guān)系。（三）考馬斯亮藍(lán)法：6（四）酸性品紅法：經(jīng)電泳后濾紙置于0.2％酸性品紅溶液中（2g酸性品紅溶解于500ml甲醇，400ml蒸餾水和100ml冰乙酸中）加熱染色15min；取出后浸入乙酸甲醇溶液（500ml甲醇，400ml蒸餾水和100ml冰乙酸）15min；然后浸入10％乙酸溶液，每次20min，至背景無(wú)色為止。如欲進(jìn)行比色，可用0.1mol/L氫氧化鈉浸泡2h，在波長(zhǎng)570nm處比色。（五）氨基萘酚磺酸法：聚丙烯酰胺凝膠電泳后，把凝膠暴露在空氣中幾分鐘，或在2mol/LHCl中浸一下使表層蛋白變性，再在0.003％氨基萘酚磺酸的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（Ph6.8）中染3min，在紫外光下可顯黃綠色熒光。這樣的染色可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性。如不需保留活性，可先在3mol/LHCl中浸2min以上使蛋白質(zhì)充分變性，在染色。（四）酸性品紅法：7二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色：1、過(guò)碘酸－Schiff氏試劑顯色法：①試劑：過(guò)碘酸液；還原液；亞硫酸品紅液；亞硫酸鹽沖洗液等。②顯色步驟：將含有樣品的濾紙浸在70％乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min，用70％乙醇洗1次，在還原液中浸5-8min，再用70％乙醇洗1次，在亞硫酸品紅液中浸24-25min，用亞硫酸鹽沖洗液洗3次，并用乙醇脫水后，放在玻璃板上吹干。顯色結(jié)果：在黑灰色的底板上呈現(xiàn)紫紅色。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)82、甲苯胺藍(lán)顯色法：①試劑：試劑甲：1.2g過(guò)碘酸溶解在30ml蒸餾水中，加15ml0.5mol/L乙酸鈉和100ml96％乙醇?，F(xiàn)配現(xiàn)用。試劑乙：100ml甲醇加20ml冰乙酸及80ml蒸餾水。試劑丙：溴水，試劑?。?0g/L甲苯胺藍(lán)水溶液，試劑戊：40g/L鉬酸銨溶液。②顯色步驟：將點(diǎn)有樣品的濾紙依次在試劑甲中浸15min，試劑丙溴水中浸15min，用自來(lái)水漂洗，再在試劑丁中浸30min，自來(lái)水漂洗至沒有藍(lán)色染料滲出（30-40min）后，再依次在試劑戊中浸3min，試劑乙中浸15min，丙酮中浸2min后在空氣中干燥。顯色結(jié)果：糖蛋白部分染成藍(lán)色，背景帶有紅紫色。2、甲苯胺藍(lán)顯色法：93、阿爾新藍(lán)顯色法：聚丙烯酰胺凝膠在12.5％三氯乙酸中固定30min后，再用蒸餾水輕輕漂洗。放入1％過(guò)碘酸液（在3％乙酸中）中氧化50min。用蒸餾水反復(fù)洗滌去除多余的過(guò)碘酸鹽，再放入0.5％偏重亞硫酸鉀中還原剩余的過(guò)碘酸鹽30min，再用蒸餾水洗滌，浸在0.5％阿爾新藍(lán)（在3％乙酸中）溶液中染4h。3、阿爾新藍(lán)顯色法：10（二）脂蛋白的顯色：1、蘇丹黑顯色法：將0.1g蘇丹黑B溶解于煮沸的100ml60％的乙醇溶液中，制備成飽和溶液，冷卻后過(guò)濾兩次，備用。顯色時(shí)將點(diǎn)有樣品的濾紙浸于上述溶液中，3h后取出，用50％乙醇溶液洗滌兩次，每次15min，空氣干燥。聚丙烯酰胺凝膠電泳中預(yù)染法：加蘇丹黑B到無(wú)水乙醇中成飽和液，并振搖使乙?；?。用前過(guò)濾。按樣品液的1/10量加入樣品液中染色1h或4℃過(guò)夜，染色后的樣品再進(jìn)行電泳。（二）脂蛋白的顯色：112、油紅－O顯色法：0.04g油紅－O溶解于100ml60％乙醇中，30℃放置過(guò)夜（16h）使充分飽和后，在30℃下濾去多余的染料，澄清液即可用于染色。將濾紙浸入染料液中，在30℃下染色18h后，用水沖洗，使背景變淺，在空氣中干燥。脂蛋白為紅色，背景為桃紅色。本法在30℃以下顯色時(shí)，會(huì)引起染料沉淀。2、油紅－O顯色法：12第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定一般說(shuō)來(lái)，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為20.0%左右，豬肉9.5%，兔肉21%，雞肉20%，牛乳3.5%，帶魚18.0%，大豆40%，面粉9.9%，菠菜2.4%，黃瓜1.0%，蘋果1.4%。測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過(guò)程控制均具有極其重要的意義。一些蛋白質(zhì)的含氮量一般為15%～17.6%，有的上下浮動(dòng)，可以測(cè)出總氮N。第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測(cè)定13一、凱氏定氮法凱式定氮法可用于所有動(dòng)植物食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定，但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，故結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。由Kieldhl于1833年提出，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的改進(jìn)，迄今已演變?yōu)槌Ａ俊⑽⒘?、自?dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法，書中只介紹前三種。一、凱氏定氮法14（一）常量凱氏定氮法：1、原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。①用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。②也可以用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過(guò)量的酸。整個(gè)過(guò)程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定。（一）常量凱氏定氮法：15（1）樣品消化：總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4＝NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%），濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮；濃硫酸又具有氧化性，將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。在消化反應(yīng)中，為加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)：①硫酸鉀：作為增溫劑，加入硫酸鉀可以提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解。純硫酸沸點(diǎn)340℃，至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。②硫酸銅：硫酸銅起催化劑的作用。還可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，以及下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。③氧化劑：如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。（1）樣品消化：16（2）蒸餾：消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。（3）吸收與滴定：①用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）國(guó)標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。指示劑：紅色→綠色→紅色（酸）（堿）（酸）②用過(guò)量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過(guò)剩的酸液，用甲基紅指示劑。（2）蒸餾：172、儀器此法可用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定，是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T5009.5-1985）。3、試劑4、操作方法取樣：固體樣品0.2-2g，半固態(tài)樣2-5g，液體樣品10-20ml。消化劑：硫酸銅0.5g，硫酸鉀10g，濃硫酸20ml。消化結(jié)束：液體變藍(lán)綠色透明后，再繼續(xù)加熱微沸30min。蒸餾：以奈氏試劑檢查，如無(wú)紅棕色物生成，表示蒸餾完畢，即可停止加熱。以奈氏試劑〔Nessler試劑，K2（HgI4）〕檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉淀。配制：方法1：3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時(shí)過(guò)濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。方法2：溶解11.5gHgI2+KI10g于適量少許水，后加水稀釋至50ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲(chǔ)存于棕色瓶中。2、儀器185、結(jié)果計(jì)算：式中：c－HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;V1－滴定樣品吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；V2－滴定空白吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，ml；m－樣品質(zhì)量，g；F－氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；M－1/2N2摩爾質(zhì)量，14.01g/moL。5、結(jié)果計(jì)算：196、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：①所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。②消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。③消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。④樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過(guò)氧化氫2－3m1后再繼續(xù)加熱消化。6、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：20⑥若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g可按每克試樣5m1的比例增加硫酸用量。⑦—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品．如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣。⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。⑩硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40℃，否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源．否則可能造成吸收液倒吸。混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。⑥若取樣量較大，如干試樣超過(guò)5g可按每克試樣5m1的21（二）微量凱氏定氮法：1、原理：同常量凱氏定氮法。2、儀器3、試劑4、操作方法：與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50ml→10ml；滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L→0.01mol/L；可用微量滴定管。取樣量較少。樣品消化步驟同常量法。滴定：餾出液用0.01000mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。同時(shí)做一空白試驗(yàn)。（二）微量凱氏定氮法：225、結(jié)果計(jì)算6、說(shuō)明：①蒸餾前給水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測(cè)定結(jié)果。②20g/L硼酸吸收液每次用量為25ml，用前加入甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑兩滴。③在蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過(guò)程中不得?；饠鄽?，否則將發(fā)生倒吸。加堿要足量，操作要迅速；漏斗應(yīng)采用水封措施，以免氨由此逸出損失。5、結(jié)果計(jì)算23（三）自動(dòng)凱氏定氮法：是指將常量凱氏定氮裝置組裝成具有自動(dòng)操作功能的一套裝置，其原理與試劑與常量法相同，操作方法如下：①稱取0.50-1.00g樣品，置于消化瓶?jī)?nèi)，加入硫酸銅和硫酸鉀制成的片劑兩片，加入濃硫酸10ml，將消化瓶置于紅外線消化爐中，用連接管密封住消化瓶，開啟抽氣裝置，開啟消化爐電源，30min后8個(gè)樣品消化完畢，消化液完全澄清并呈綠色。②取出消化瓶，移裝于自動(dòng)凱氏定氮儀中，連接開啟加水電鈕，加堿電鈕、自動(dòng)蒸餾滴定電鈕，開啟電源，約經(jīng)12min后由數(shù)顯裝置即可給出樣品總氮百分含量，并記錄樣品總氮百分比。根據(jù)換算系數(shù)F即可得出樣品中蛋白質(zhì)含量。③開啟排廢液電鈕和加水電鈕，排出廢液并對(duì)消化瓶進(jìn)行清洗1次。（三）自動(dòng)凱氏定氮法：24二、雙縮脲法（一）原理：當(dāng)脲（尿素，NH2—CO—NH2）加熱至150~160℃時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。NH2－CO－NH2+NH2－CO－NH2→NH2－CO－NH－CO－NH2+NH3雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)（縮二脲反應(yīng)）。由于蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵－CO－NH－，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。故也能出現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸光度法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長(zhǎng)為560nm。注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化二、雙縮脲法25（二）方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍：本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。（三）儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）。（四）試劑：堿性硫酸銅溶液；四氯化碳。（五）操作方法：①采用凱氏法測(cè)出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品測(cè)定：準(zhǔn)確稱取樣品適量（使蛋白質(zhì)含量在40-110mg之間）于50ml納氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測(cè)定吸光度A。用測(cè)得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，進(jìn)而由此求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。（六）結(jié)果計(jì)算：蛋白質(zhì)含量＝m×100/m1（mg/100g）式中：m－由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m1－樣品質(zhì)量，g。（二）方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍：26（七）說(shuō)明及注意事項(xiàng)：①蛋白質(zhì)種類不同，對(duì)發(fā)色程度影響不大。②標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完整后，無(wú)需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線。③含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚脫脂。④樣品中有不溶性成分存在時(shí)，會(huì)給比色測(cè)得帶來(lái)不便，此時(shí)可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進(jìn)行測(cè)得。⑤當(dāng)肽鏈中含脯氨酸時(shí)，若有多量糖類共存，則顯色不好，會(huì)使測(cè)得值偏低。⑥堿性硫酸銅溶液由0.1mol氫氧化鉀、5g酒石酸鉀鈉，1.6g硫酸銅溶于水后加水至1000ml配成。（七）說(shuō)明及注意事項(xiàng)：27三、紫外吸收法（一）A280nm光吸收法：1、原理：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（胨、肽和氨基酸）的芳香環(huán)殘基【—NH—CH（R）—CO—】在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)一定波長(zhǎng)的光具有選擇吸收作用，在波長(zhǎng)（280nm）下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度（3—8mg/mL）成直線關(guān)系，因此，通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的吸光度，并參照事先用凱式定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品蛋白質(zhì)含量。三、紫外吸收法282、適用范圍：本法操作簡(jiǎn)單迅速，常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3、儀器4、試劑5、操作方法：①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取試樣1.00g，如前處理，吸取的每毫升樣品溶液中含有3-8mg的蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作條件測(cè)定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)的含量。6、結(jié)果計(jì)算：蛋白質(zhì)含量＝m×100％（％）式中：m－由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m1－測(cè)定樣品溶液所相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，mg。2、適用范圍：297、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：①測(cè)定牛奶樣品時(shí)的操作：準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2ml于25ml納氏比色管中，用95％-97％的冰乙酸稀釋至標(biāo)線，搖勻，以95％-97％的冰乙酸為參比液，用1cm比色皿于280nm處測(cè)定吸光度，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品蛋白質(zhì)含量。②測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)將表皮的顏色去掉。③溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20-30℃。7、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：30（二）肽鍵紫外光測(cè)定法：蛋白質(zhì)溶液在238nm下均有光吸收，其吸收強(qiáng)弱與肽鍵多少成正比，根據(jù)這一性質(zhì)，可測(cè)定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作對(duì)照，求出蛋白質(zhì)含量。本法比280nm吸收法靈敏。在50-500mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。A260nm和A280nm比值法：1、原理：凡是有共軛雙鍵的物質(zhì)，均具有紫外吸收值。因此，若樣品中含有核酸，則嘌呤、嘧啶類堿基對(duì)蛋白質(zhì)的測(cè)定產(chǎn)生干擾，應(yīng)加以校正。核酸在260nm處的紫外吸收值大于280nm處的，但蛋白質(zhì)剛好相反。利用此性質(zhì)，通過(guò)計(jì)算可以適當(dāng)校正核酸對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾。（二）肽鍵紫外光測(cè)定法：312、測(cè)定：取一定量的樣品稀釋液，分別測(cè)定樣品的A260nm和A280nm，計(jì)算A280nm/A260nm的比值后，從表10-2中查出校正因子F值，同時(shí)可查出該樣品中混雜的核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。將F值代入，由下列公式可直接計(jì)算該樣品的蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量＝F×A280nm×n/d（mg/ml）式中：A280nm－該樣品液在280nm波長(zhǎng)下的吸收值；d－石英杯的厚度，cm；n－樣品的稀釋倍數(shù)。2、測(cè)定：32A215nm和A225nm的吸收差法：3、樣品測(cè)定：取一定量的樣品液，以蒸餾水調(diào)零，分別測(cè)定A215nm和A225nm，并求出差值A(chǔ)215nm－A225nm，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收差值作對(duì)照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。本法在20-100mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。A215nm和A225nm的吸收差法：33四、福林－酚比色法（一）原理：蛋白質(zhì)與福林（Folin）－酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性酮鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸－磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。（二）試劑：福林－酚試劑甲，福林－酚試劑乙，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/ml）。四、福林－酚比色法34（三）操作方法：吸取一定量的樣品稀釋液，加入試劑甲3.0ml，置于25℃水浴中保溫10min，再加入試劑乙0.3ml，立即混勻，保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定A750nm值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液作對(duì)照，求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。本法在0—60mg/L蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。（四）說(shuō)明：福林－酚法靈敏度高，酚類和檸檬酸對(duì)該法均有干擾。（三）操作方法：35五、考馬斯亮藍(lán)染料比色法（一）原理：考馬斯亮藍(lán)G－250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過(guò)范得華引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。此法簡(jiǎn)單迅速，適合大量樣品的測(cè)定，靈敏度與福林－酚法相似。但不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。（二）試劑：①牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；②染料試劑：稱取考馬斯亮藍(lán)G-25060mg，溶于100ml,3％過(guò)氯酸溶于中，過(guò)濾，儲(chǔ)于棕色瓶中。（三）操作方法：吸取樣品液2ml，加染料試劑2ml，混勻，以介質(zhì)溶于調(diào)零，測(cè)定A620nm，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)照，求出蛋白質(zhì)含量。本法在0-100mg/L蛋白質(zhì)范圍呈良好的線性關(guān)系。五、考馬斯亮藍(lán)染料比色法36六、水楊酸比色法（一）原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍(lán)色化合物，可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。（二）儀器（三）試劑（四）操作方法：①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品處理：取樣0.20-1.00g，加入15ml濃硫酸，0.5g硫酸銅和4.5g無(wú)水硫酸鈉，消化。③樣品測(cè)定：取一定量消化液定容，比色。六、水楊酸比色法37（五）結(jié)果計(jì)算：總氮量＝（m×K）×100％/（m1×1000×1000）式中：m―從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣液含氮量，μg；K―樣品溶液稀釋倍數(shù)；m1－樣品質(zhì)量，g。（四）說(shuō)明：①應(yīng)在樣品消化當(dāng)天進(jìn)行比色測(cè)定；②溫度對(duì)顯色影響很大，應(yīng)嚴(yán)格控制溫度；③此法結(jié)果與凱氏定氮基本一致；④試劑配制必須標(biāo)準(zhǔn)。（五）結(jié)果計(jì)算：38七、紅外光譜法（一）原理：食品中不同的功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段（6.47μm）和近紅外波段（3300-3500nm，2028-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量。（二）應(yīng)用：紅外牛乳分析儀采用中紅外光譜法測(cè)定牛乳蛋白質(zhì)含量，近紅外光譜儀也廣泛應(yīng)用于食品蛋白質(zhì)分析。七、紅外光譜法39八、4,4’-二羧基-2,2－聯(lián)喹啉（BCA）法（一）原理：二價(jià)銅離子在堿性條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子和獨(dú)特的BCA試劑（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)一價(jià)銅離子，形成淺紫色的反應(yīng)復(fù)合物。反應(yīng)形成顏色的深淺與一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度成正比。（二）方法：①蛋白質(zhì)溶液和含有BCA鈉鹽、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、pH11.25的BCA試劑一步混合；②在37℃保溫30min或室溫下放置2h，或60℃保溫30min。溫度的選擇取決于靈敏度的要求。較高的溫度導(dǎo)致較深的顏色反應(yīng)；③在562nm處比色測(cè)定，并作空白試驗(yàn)；④用BSA（牛血清蛋白）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（三）應(yīng)用：BCA法已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和純化中。此法對(duì)測(cè)定復(fù)雜食品體系中蛋白質(zhì)的適用性還未見報(bào)道。八、4,4’-二羧基-2,2－聯(lián)喹啉（BCA）法40優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度與福林－酚法相似，微量BCA法的靈敏度（0.5-10μg）稍高于福林－酚法；②一步混合的操作更簡(jiǎn)單；③所用試劑比福林－酚法簡(jiǎn)單；④非離子型表面活性劑和緩沖液不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾；⑤中等濃度的變性劑（4mol/L鹽酸胍或3mol/L尿素）不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾缺點(diǎn)：①反應(yīng)產(chǎn)生的顏色不穩(wěn)定，需要仔細(xì)控制比色時(shí)間；②還原糖對(duì)此反應(yīng)產(chǎn)生的干擾比對(duì)福林－酚法更大；③不同蛋白質(zhì)反應(yīng)引起的顏色變化與福林－酚法相似；④比色的吸光度與蛋白質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。優(yōu)點(diǎn)：41九、比濁法（一）原理：低濃度（3％－10％）的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白沉淀形成蛋白質(zhì)顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過(guò)程中的衰減而確定，輻射光傳送過(guò)程中的衰減是由于蛋白質(zhì)顆粒的散射造成的，輻射光衰減的程度與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。九、比濁法42（二）操作方法：測(cè)定小麥蛋白質(zhì)的常規(guī)方法為磺基水楊酸法，具體如下：①小麥面粉用0.05mol/L氫氧化鈉溶液萃??；②將溶于堿性溶液的蛋白質(zhì)從原料中離心分離；③磺基水楊酸和蛋白質(zhì)溶液混合；④在540nm處測(cè)定其濁度，并扣去空白；⑤蛋白質(zhì)的含量可根據(jù)凱氏定氮法校正過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。（二）操作方法：43（三）應(yīng)用：比濁法已經(jīng)用于測(cè)定小麥面粉和玉米的蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn)：①快速、可在15min內(nèi)完成；②測(cè)定結(jié)果不包括除了核酸外的非蛋白質(zhì)含量。缺點(diǎn)：①不同的蛋白質(zhì)沉淀速度不同；②濁度隨酸試劑濃度的不同而變化；③核酸也能被酸試劑沉淀。（三）應(yīng)用：44十、杜馬斯法（燃燒法）（一）原理：樣品在高溫下（700-800℃）燃燒，釋放的氮?dú)庥蓭釋?dǎo)檢測(cè)器（TCD）的氣相色譜儀測(cè)定。測(cè)得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含量。（二）操作方法：樣品（100-500mg）稱量后置于樣品盒中，放入具有自動(dòng)裝置的燃燒反應(yīng)器中，釋放的氮?dú)庥蓛?nèi)置的氣相色譜儀測(cè)定。（三）應(yīng)用：燃燒法適用于所有種類的食品，AOAC方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品。十、杜馬斯法（燃燒法）45優(yōu)點(diǎn)：①是凱氏定氮法的一個(gè)替代法；②不需要任何有害化合物；③可在3min內(nèi)完成；④最先進(jìn)的自動(dòng)化儀器可在無(wú)人看管的狀態(tài)下分析多達(dá)150個(gè)樣品。缺點(diǎn)：①需要的儀器昂貴；②非蛋白氮也包括在內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：46第四節(jié)蛋白質(zhì)的末端測(cè)定一、N－末端測(cè)定－丹磺?；ǎㄒ唬┰恚旱鞍踪|(zhì)的α－氨基與丹磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng)，生成DNS-蛋白質(zhì)，經(jīng)水解可生成DNS－氨基酸。通過(guò)分析DNS－氨基酸，可確定蛋白質(zhì)的N－末端氨基酸。（二）儀器和試劑第四節(jié)蛋白質(zhì)的末端測(cè)定一、N－末端測(cè)定－丹磺酰化法47（三）操作方法：1、氨基酸的丹磺?；翰捎脤游龇ǖ玫礁鞣NDNS-氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。2、蛋白質(zhì)樣品N-末端氨基酸的DNS化：取樣0.5mg，置于具塞玻璃試管中，用少量水溶解后，加入0.5mL，0.2mol/L碳算清鈉溶液。再加入0.5mlDNS-Cl丙酮溶液，用三乙胺調(diào)至pH9.0-9.5，塞好塞子，于40℃烘箱中反應(yīng)2h，或室溫放置2-4h，生成DNS-蛋白質(zhì)。（三）操作方法：483、DNS-蛋白質(zhì)水解：DNS化反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸去丙酮，加入0.5ml，6mol/L鹽酸溶解DNS-蛋白質(zhì)。全部移入水解管，抽真空封管，于110℃烘箱中水解18-24h。開管后蒸去鹽酸，加少量水，在蒸干。重復(fù)2-3次，除盡鹽酸。4、DNS-氨基酸的抽提：將上述水解產(chǎn)物加0.5ml水，用1mol/LHCl調(diào)至pH2-3。加入0.5ml乙酸乙酯抽提，除去乙酸乙酯，于干燥器中備用。5、DNS-氨基酸的層析與檢測(cè)：將抽提的DNS-氨基酸和標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸分別進(jìn)行聚酰胺薄膜層析。將圖譜用360nm或280nm波長(zhǎng)的紫外燈檢測(cè)，進(jìn)行比較。3、DNS-蛋白質(zhì)水解：49二、蛋白質(zhì)及多肽C-末端測(cè)定及順序分析（羧肽酶法）（一）原理：一般先進(jìn)行末端基測(cè)定，然后進(jìn)行順序分析。通常C－末端基測(cè)定要比N－末端基的測(cè)定困難。目前普遍采用羧肽酶法進(jìn)行C-末端基測(cè)定及C-端氨基酸順序分析。羧肽酶是一類外肽酶，這些酶與蛋白質(zhì)或多肽作用時(shí)，能從C-末端氨基酸殘基開始順序降解，并逐個(gè)釋放出游離C－端氨基酸。二、蛋白質(zhì)及多肽C-末端測(cè)定及順序分析（羧肽酶法）50蛋白質(zhì)或多肽在羧肽酶作用下，被逐步降解及釋放的氨基酸種類和數(shù)目隨時(shí)間而發(fā)生變化，將經(jīng)過(guò)一定間隔時(shí)間反應(yīng)的樣品分別取出，進(jìn)行酸化失活處理后可用自動(dòng)分析儀或HPLC儀進(jìn)行快速測(cè)定，根據(jù)不同時(shí)間取樣的分析結(jié)果便能初步確定C-末端基為何種氨基酸。若以酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)所釋放的各氨基酸量（mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，然后根據(jù)氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線即可進(jìn)一步判斷和確定肽鏈C端的氨基酸順序。肽鏈C端的氨基酸順序測(cè)定的關(guān)鍵在于測(cè)出第一個(gè)釋放的為何種氨基酸，一般最好采用兩種以上C－末端測(cè)定方法進(jìn)行比較和驗(yàn)證才可靠。蛋白質(zhì)或多肽在羧肽酶作用下，被逐步51（二）試劑：羧肽酶Y；牛胰核糖核酸酶A；降解緩沖液。（三）操作步驟：1、酶液和樣品溶液的制備：2、樣品酶解：3、氨基酸分析：取上清液用自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸定性或定量分析。（二）試劑：52（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、動(dòng)力曲線繪制：依據(jù)自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定所提供的數(shù)據(jù)，以酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)不同時(shí)間所釋放的各種氨基酸相應(yīng)的量（mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，繪制出氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線圖。2、C－末端分析結(jié)果：根據(jù)上述氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線分析，判斷和確定被測(cè)定蛋白質(zhì)的C-末端為何種氨基酸，并寫出其C－末端氨基酸排列順序。（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：53第五節(jié)氨基酸的定性測(cè)定一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)（一）茚三酮法：常用法：將點(diǎn)有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用5g/L茚三酮無(wú)水丙酮溶液噴霧，充分吹干，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過(guò)高，避免空氣中氮，以免背泛紅色），氨基酸斑點(diǎn)呈紫紅色。第五節(jié)氨基酸的定性測(cè)定54（二）吲哚醌法：1、原理：各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辨認(rèn)氨基酸。氨對(duì)吲哚鯤顯色沒有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對(duì)干燥的環(huán)境中才能保存。2、試劑：顯色劑；底色退色劑。3、顯色步驟：（二）吲哚醌法：55（三）鄰苯二甲醛法：鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量，并推廣應(yīng)用于乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的檢出和定量。1、原理：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和455nm。2、試劑：鄰苯二甲醛顯色液，巰基乙醇，三乙胺，丙酮，石油醚等。3、顯色步驟：將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中1min，冷風(fēng)吹干，在溫度18℃以下，濕度50％－90％之間顯色0.5h，于紫外燈下觀察熒光點(diǎn)。4、說(shuō)明：顯色時(shí)必須有一定的濕度，以便氨基酸溶解。（三）鄰苯二甲醛法：56二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)（一）精氨酸的顯色－坂口（Sakaguchi）反應(yīng)：1、第一種方法：試劑①：5g尿素溶解于100ml，0.1g/Lα－萘酚乙醇中，使用前，每100ml加約5gKOH；試劑②：0.7ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。顯色步驟：在點(diǎn)有樣品的濾紙上噴試劑①后，在空氣中吹幾分鐘，再噴試劑精氨酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對(duì)含精氨酸的蛋白質(zhì)也適用。2、第二種方法：試劑①：1g/L8-羥基喹啉的丙酮溶液；試劑②：0.02ml溴水溶解于100ml，5％NaOH中。顯色步驟：將點(diǎn)有樣品的濾紙烘干后，噴上試劑①，吹干后，再噴試劑②。精氨酸或其他胍類物質(zhì)顯橘紅色。二、個(gè)別氨基酸的顯色反應(yīng)57（二）胱氨酸和半胱氨酸的顯色：試劑①：1.5g亞硝基鐵氰化鈉溶于5ml，2mol/L硫酸溶液中，家95ml甲醇。使用時(shí)在每100ml上述溶液中加10ml28％氨水，過(guò)濾除去沉淀，清液僅能保持1d。試劑②：2g氰化鈉溶于5ml水中，然后加95ml甲醇。顯色步驟：半胱氨酸顯色：在濾紙上噴試劑①的清液，5min后半胱氨酸顯紅色。胱氨酸顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑①的清液，5min后胱氨酸顯紅色。（二）胱氨酸和半胱氨酸的顯色：58（三）甘氨酸的顯色：試劑：0.1g鄰苯二甲醛溶于100ml77％乙醇中。顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力棕色。吲哚醌顯色后，再用此試劑仍有效。（四）脯氨酸的顯色：試劑：1g吲哚醌和1.5g乙酸鋅、5ml蒸餾水混合，再加入95ml異丙醇。顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上試劑，80-85℃烘箱內(nèi)放置30min，脯氨酸顯藍(lán)色，再以30℃溫水漂洗除去多余的試劑后，背景為白色或淺黃色。（三）甘氨酸的顯色：59（五）絲氨酸和羥賴氨酸的顯色：試劑①：0.0345mol/L過(guò)碘酸鈉；試劑②：15g乙酸銨加0.3ml冰乙酸，加1ml乙酰丙酮，用甲醇稀釋到100ml。顯色步驟：點(diǎn)有樣品的濾紙吹干，先噴試劑①，快干時(shí)噴試劑②，室溫放置2h，紫外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點(diǎn)，在紫外線下都有熒光。（五）絲氨酸和羥賴氨酸的顯色：60（六）羥脯氨酸的顯色：試劑①：1g吲哚醌溶于100ml乙醇和10ml冰乙酸。試劑②：1g對(duì)二甲基氨基苯甲醛溶于100ml丙酮，濃鹽酸（9＋1）混合液中。顯色步驟：將待鑒定的溶于點(diǎn)于小方塊紙上，干后先點(diǎn)上試劑①，熱風(fēng)吹干。這時(shí)純羥脯氨酸呈墨綠色，春脯氨酸呈深藍(lán)色；然后再點(diǎn)上試劑②吹干，如溶液中含有羥脯氨酸即轉(zhuǎn)變?yōu)槊倒寮t色。（六）羥脯氨酸的顯色：61（七）色氨酸的顯色：1、第一種方法：試劑：1g對(duì)二甲氨基苯甲醛加90ml丙酮、10ml濃鹽酸。新鮮配制。顯色：點(diǎn)有樣品的濾紙干燥后，噴上試劑，在室溫下放置幾分鐘后，色氨酸顯藍(lán)色或紫紅色。2、第二種方法：試劑：10ml35％的甲醛加10ml25％鹽酸、20ml無(wú)水乙醇。顯色：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上試劑后，100℃烘5min，色氨酸在波長(zhǎng)紫外光下呈現(xiàn)熒光（黃－橙－帶綠色）。（七）色氨酸的顯色：62（八）酪氨酸的顯色：試劑①：0.1％α－亞硝基－β－萘酚的95％乙醇溶液。試劑②：10％硝酸水溶液。顯色：點(diǎn)有樣品的濾紙噴上試劑①后，吹干，再噴試劑②，然后在100℃烘3min，酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h后轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色。（九）酪氨酸和組氨酸的顯色－pauly反應(yīng)：試劑①：4.5g對(duì)氨基苯磺酸與45ml，12mol/L鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500ml。試劑②：10％碳酸鈉水溶液。顯色：點(diǎn)有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻后再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多肽顯橘紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。（八）酪氨酸的顯色：63第六節(jié)氨基酸定量測(cè)定一、氨基酸的一般定量測(cè)定（一）甲醛滴定法：1、原理：氨基酸具有酸性羧基（-COOH）和堿性的氨基（-NH2），它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽，加入甲醛溶液時(shí)，-NH2與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定-COOH，并用間接的方法測(cè)定氨基酸總量。2、方法特點(diǎn)及應(yīng)用：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過(guò)程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測(cè)定）。3、試劑第六節(jié)氨基酸定量測(cè)定一、氨基酸的一般定量測(cè)定644、操作方法：吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加入至標(biāo)線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加入60ml，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，供計(jì)算總酸含量。加入10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。同時(shí)取80ml蒸餾水置于另一個(gè)200ml潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至Ph8.2，再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至Ph9.2，作為試劑空白實(shí)驗(yàn)。4、操作方法：655、結(jié)果計(jì)算：式中：V1－樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（Ph9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V2－空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；c－氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；m－測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g；0.014－1/2N2的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。6、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：①此法適用于測(cè)定食品中的游離氨基酸；②混濁和色深樣液可不經(jīng)處理直接測(cè)定。5、結(jié)果計(jì)算：66（二）電位滴定法1、原理根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成原電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH判斷滴定終點(diǎn)。（二）電位滴定法67（三）茚三酮比色法：1、原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測(cè)定。該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長(zhǎng)為570nm。故據(jù)此可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。（三）茚三酮比色法：682、儀器3、試劑4、操作方法：①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：②樣品測(cè)定：吸取澄清的樣品溶液1-4ml，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測(cè)定吸光值A(chǔ),據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得氨基酸質(zhì)量（μg）。5、結(jié)果計(jì)算：氨基酸含量＝m×100/(m1-1000)（mg/100g）式中：m－從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的氨基酸含量，μg；m1－測(cè)定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g。2、儀器696、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：①樣品處理：取樣5-10g或吸取樣液5-10ml，置于燒杯中，加入50ml蒸餾水和5g活性炭，加熱煮沸，過(guò)濾。用30-40ml熱水洗滌活性炭，收集濾液于100ml容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備用。②茚三酮易氧化變色，使用前需進(jìn)行純化處理。6、說(shuō)明及注意事項(xiàng)：70（四）非水溶液滴定法：1、原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰乙酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈現(xiàn)中性，假如在冰醋酸中就顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強(qiáng)酸進(jìn)行滴定。本法適合于氨基酸成品的含量測(cè)定。允許測(cè)定的范圍是幾十毫克的氨基酸。2、試劑（四）非水溶液滴定法：713、操作方法：①直接法（適用于能溶解于冰乙酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg左右，溶解于20ml冰乙酸中，加2滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定（用10ml體積的微量滴定管），終點(diǎn)為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍(lán)色?？瞻坠転椴缓被岬谋宜嵋?，滴定至同樣的終點(diǎn)顏色。②回滴法（適用于不易溶解于冰乙酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品30-40mg，溶解于5ml，0.1mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加2滴甲基紫指示劑，剩余的酸以乙酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過(guò)綠、藍(lán)至初次出現(xiàn)不退的紫色為終點(diǎn)。3、操作方法：724、說(shuō)明：①不易溶解于冰乙酸的氨基酸，但能溶于高氯酸可以用回滴法測(cè)定的氨基酸有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。②谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于2ml加酸中，再加20ml冰乙酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。4、說(shuō)明：73（五）鄰苯二甲醛法（OPA法）：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和455nm。本法可用于游離氨基酸的測(cè)定，靈敏度較茚三酮法高100倍以上。不足之處：鄰苯二甲醛與脯氨酸不產(chǎn)生熒光，與半胱氨酸熒光值太低。（五）鄰苯二甲醛法（OPA法）：74（六）三硝基苯磺酸法：三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測(cè)定氨基酸的重要試劑之一。TNBS在偏堿性的條件下與氨基酸反應(yīng)，先形成中間絡(luò)合物；中間絡(luò)合物在光譜上有2個(gè)吸收值相近的高峰，分別位于355nm和420nm附近。然而溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯－氨基酸（TNP-氨基酸），420nm處的吸收值顯著下降，而350nm附近的吸收峰則移至340nm處。利用上述反應(yīng)特性，可在420nm處（偏堿性溶液中）或在340nm處（偏酸性溶液中）對(duì)氨基酸進(jìn)行定量測(cè)定。本法允許測(cè)定范圍是0.05-0.4μmol氨基酸。（六）三硝基苯磺酸法：75（七）乙酰丙酮和甲醛熒光法：1、原理：氨基酸與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成N-取代基-2,6-二甲基-3,5-二乙?；?1,4-二氫吡啶，產(chǎn)生黃－綠色熒光，可用熒光分析法檢測(cè)。2、試劑：混合試劑：取1mol/L乙酸鈉溶液10ml，加入乙酰丙酮溶液0.4ml和30％甲醛溶液1ml，用水稀釋至30ml。3、操作方法：取氨基酸液1ml，加入混合試劑1ml，用棉花塞滿試管口，避光于100℃下加熱10min，冷卻，加水2ml，然后測(cè)定熒光值。（七）乙酰丙酮和甲醛熒光法：76二、個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定（一）賴氨酸的測(cè)定：1、原理：用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基，是賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）反應(yīng)，生成ε-DNP-賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取，在波長(zhǎng)390nm處有吸收峰，從而求出樣品中游離賴氨酸的含量。2、試劑：氯化銅溶液；磷酸三鈉溶液；硼酸鹽緩沖液；磷酸銅懸浮液；1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）溶液；賴氨酸-HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液；100g/L丙氨酸溶液。二、個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定773、測(cè)定：①稱取通過(guò)40目篩的均勻試樣1.00g，置于100ml燒瓶中。另吸取賴氨酸－HCl標(biāo)準(zhǔn)工作液5ml（相當(dāng)于1mg賴氨酸－HCl），連同試劑空白同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。②向各燒瓶中加入25ml磷酸銅懸浮液，然后再加10％丙氨酸1.0ml，振搖15min吸取10％FDNB溶液0.5ml。置于各處理燒瓶中，將燒瓶置沸水中加熱15min。③取出燒瓶，立即加入1mol/L鹽酸溶液25ml，并不斷振搖使之酸化和分散均勻。④燒瓶中的溶液冷取至室溫，用水稀釋至100ml，取約40ml懸浮液進(jìn)行離心。⑤用25ml二乙基醚提取上清液3次，除去醚。并將溶液收集于有刻度的試管中，于65℃水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的體積。3、測(cè)定：78⑥吸取上述各處理液10ml，分別于95％乙醇溶液10ml混合，用濾紙過(guò)濾。⑦用試劑空白液調(diào)零，測(cè)定樣液A390nm，與賴氨酸－HCl標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照，求出樣品中賴氨酸－HCl的含量。本法在0-40mg/L賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說(shuō)明：①添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸濃度，有助于賴氨酸－HCl濃度具有良好的線性關(guān)系。②用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDNB的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在390nm處存在干擾。⑥吸取上述各處理液10ml，分別于95％乙醇溶液10ml混79（二）色氨酸的測(cè)定：1、原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生成哈爾滿化合物（nor-harman），具有特征熒光值，可以進(jìn)行定量測(cè)定。2、試劑：0.3mmol/L三氯化鐵-三氯乙酸溶液；2％甲醛；色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。（二）色氨酸的測(cè)定：803、測(cè)定：稱取樣品粉末100～200mg于離心管中，加入4ml乙醚，搖勻后過(guò)夜，以3000r/min速度離心。將乙醚提取液移入試管中，并用乙醚洗滌殘?jiān)?次，收集乙醚液于試管中，于40℃水浴中除去乙醚。殘留物中加入6.25mol/L氫氧化鈉4ml，火焰封口，于110℃水解16-24h。水解液用4mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)至ｐH6～8后，用水定容至50ml，過(guò)濾備用。吸取濾液0.2ml，加入2％甲醛0.2ml和0.3mmol/L三氯化鐵-三氯乙酸溶液2ml，搖勻后于100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻后用水定容至10ml。在激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)449nm條件下，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，與色氨酸標(biāo)樣對(duì)照，求出樣品中色氨酸含量。本法在0～10mg/L色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。3、測(cè)定：81（三）苯丙氨酸的測(cè)定：1、原理：苯丙氨酸與茚三酮及銅鹽反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，其熒光復(fù)合物在激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)490nm處可產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸對(duì)照，可求出樣品中苯丙氨酸的含量，檢測(cè)時(shí)加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增強(qiáng)這一反應(yīng)。2、試劑：二肽-茚三酮試劑；銅試劑；0.6mol/L三氯乙酸溶液；標(biāo)準(zhǔn)苯丙氨酸溶液。（三）苯丙氨酸的測(cè)定：823、操作方法：①血清的去蛋白處理：用三氯乙酸溶液沉淀蛋白質(zhì)，離心除去。②樣品測(cè)定：吸取樣品液100μL，置于樣品管中，另吸取苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液25μL，加0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL，然后兩管均加入至200μL，同時(shí)作試劑空白分析。再向各管加入二肽－茚三酮0.3ml。放在75℃水浴中保溫80min。取出冷卻，加入2.5ml銅試劑，振搖均勻，90min內(nèi)在激發(fā)波長(zhǎng)為385nm，發(fā)射波長(zhǎng)472nm條件下，測(cè)定樣品的熒光值，與苯丙氨酸標(biāo)樣對(duì)照，求出樣品游離苯丙氨酸含量。3、操作方法：834、結(jié)果計(jì)算：式中：f1－檢樣熒光值；f2－標(biāo)樣熒光值；f0－試劑空白熒光值；m’－標(biāo)樣氨基酸質(zhì)量，mg；m－樣品質(zhì)量，mg。4、結(jié)果計(jì)算：845、說(shuō)明：①反應(yīng)溫度、時(shí)間對(duì)熒光物質(zhì)的生成有顯著影響；②熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性：從保溫完畢加入銅試劑后算起，相對(duì)熒光值約穩(wěn)定90min；③苯丙氨酸和茚三酮、銅鹽作用的產(chǎn)物如果沒有二肽存在幾乎沒有熒光產(chǎn)生。④反應(yīng)溶液的pH值低于5.8，產(chǎn)生的熒光較低，pH大于5.8則熒光增強(qiáng)，在pH6.8時(shí)達(dá)到最高值，但專一性下降。5、說(shuō)明：85（四）酪氨酸的測(cè)定：1、原理：酪氨酸和1-亞硝酸-2-萘酚反應(yīng)，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亞硝酸鈉存在的條件下加熱，產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，可用熒光法定量測(cè)定。2、試劑：亞硝酸-萘酚試劑；0.6mol/L三氯乙酸溶液；1,2-二氯乙烷；標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（7.2mg/L）。（四）酪氨酸的測(cè)定：863、測(cè)定：①樣品去蛋白處理：三氯乙酸溶液沉淀蛋白，離心去除。②樣品測(cè)定：分別吸取樣液100μL于具塞試管1；標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液25μL和0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL于具塞試管2；0.06mol/L三氯乙酸溶液100μL于具塞試管3；各管用水補(bǔ)充容積至200μL。將各管置于55℃水浴數(shù)分鐘，加入新配制的亞硝酸萘酚試劑0.3ml，搖勻，55℃保溫20min，保溫后加水2.5ml，搖勻后加入三氯乙酸溶液3ml。充分振蕩以便使多余的試劑抽提入二氯乙烷溶液中，4000r/min離心10min，將上層水溶液移至另一個(gè)試管內(nèi)，在180min內(nèi)，于激發(fā)波長(zhǎng)468nm，發(fā)射波長(zhǎng)555nm處，測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，與氨基酸標(biāo)樣對(duì)照，求出樣品氨基酸含量。4、說(shuō)明：①熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性：從保溫完畢開始，相對(duì)熒光值在180min內(nèi)平均減少2％；②酪胺的存在對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定存在干擾。3、測(cè)定：87（五）脯氨酸的測(cè)定：1、原理：在丙酮溶劑中，脯氨酸與吲哚醌反應(yīng)形成藍(lán)色化合物，能用以測(cè)定蛋白質(zhì)水解液中的脯氨酸含量，在一定條件下（包括pH、緩沖液濃度和吲哚鯤濃度），可以在其他氨基酸存在下直接進(jìn)行測(cè)定，不受羥脯氨酸的干擾。2、試劑：pH3.9的檸檬酸鹽緩沖液；0.75g/L吲哚醌丙酮溶液；水飽和酚溶液。（五）脯氨酸的測(cè)定：883、測(cè)定：稱取蛋白質(zhì)樣品5mg，加6mol/LHCl溶液2ml，封管后于140℃水解4h。啟封，加蒸餾水稀釋至鹽酸濃度達(dá)0.25mol/L。吸取含一定量蛋白質(zhì)酸水解液0.1-0.5ml于小燒杯中，75℃干燥至恒重。殘留物加pH3.9檸檬酸鹽緩沖液0.2ml，使殘留物完全溶解后，加0.75g/L吲哚醌丙酮溶液0.25ml，混勻，于100℃烘箱內(nèi)使溶劑蒸發(fā)0.5h左右。以下步驟在避光條件下操作。先加0.5ml水飽和酚溶液，劇烈搖動(dòng)后，加1ml蒸餾水和2ml丙酮，混勻成均相溶液，立即在波長(zhǎng)598nm處，以試劑空白調(diào)零，測(cè)定樣品A598nm，與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，求出樣品中脯氨酸含量。本法在0-10mg/L氨基酸溶液范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說(shuō)明：①要獲得最佳的靈敏度及專一性，必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，即緩沖液濃度，pH值和吲哚醌濃度。②脯氨酸與吲哚醌形成的藍(lán)色化合物見光不穩(wěn)定，必須避光操作。3、測(cè)定：89（六）羥脯氨酸的測(cè)定：1、原理：羥脯氨酸在有過(guò)量丙氨酸（其作用是減少其他氨基酸的干擾）的條件下，用氯胺T氧化生成△’-吡咯啉-4-羥基-2-羧酸和吡咯-2-羧酸，它們不溶于甲苯，但將溶液加熱處理后可溶于甲苯中。所以在加熱前先用甲苯除去其他物質(zhì)，加熱后再用甲苯把這些氧化產(chǎn)物抽提，最后用對(duì)-二甲基苯甲醛試劑顯色，在波長(zhǎng)560nm處有最大吸收值，可進(jìn)行定量測(cè)定。2、試劑：（六）羥脯氨酸的測(cè)定：903、測(cè)定；酸水解：氧化和抽提：樣品測(cè)定：4、說(shuō)明：①本法對(duì)羥脯氨酸有特異性，其他氨基酸即使同時(shí)存在10000倍也無(wú)干擾。②如測(cè)定游離羥脯氨酸可省去第一步酸水解操作。3、測(cè)定；91（七）胱氨酸的測(cè)定：1、原理：用亞硫酸鹽使胱氨酸還原為半胱氨酸和S-半胱氨酸磺酸，其他含二硫鍵的物質(zhì)也被還原。通過(guò)巰基被磷鎢酸還原成鎢藍(lán)的反應(yīng)測(cè)定半胱氨酸，從而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巰基可在加磷鎢酸前先加氯化汞與巰基結(jié)合。因反應(yīng)pH為5，其他還原性物質(zhì)如尿酸、抗壞血酸也使磷鎢酸還原，通過(guò)空白對(duì)照加以去除。2、試劑：（七）胱氨酸的測(cè)定：923、測(cè)定：①取4支試管分別吸?。海?測(cè)定管：樣品液1.0ml（胱氨酸含量0.2mg／mL）；ｂ.樣品空白管：樣品液1.0ml；ｃ.標(biāo)準(zhǔn)管：胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml，蒸餾水0.5ml；ｄ.試劑空白管：蒸餾水1.0ml。②胱氨酸的還原反應(yīng)：上述各管分別加入乙酸鹽緩沖液1.0ml，亞硫酸鈉試劑0.3mL。測(cè)定管和標(biāo)準(zhǔn)管各加入蒸餾水1.7ｍｌ；樣品空白管和試劑空白管各加蒸餾水1.5mL、0.1mol／L氯化汞溶液0.2ml，混合后放置2min。3、測(cè)定：93③巰基的還原反應(yīng)和顯色：上述各管分別加磷鎢酸試劑1.0mL，混合后于15min內(nèi)，在600nm波長(zhǎng)下，以試劑空白管校正零點(diǎn)，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；以樣品空白管校正零點(diǎn)，測(cè)定樣品測(cè)定管吸光度，與氨基酸標(biāo)樣作對(duì)照，求出樣品氨基酸含量。本法在0-200mg/L氨基酸范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。4、說(shuō)明：如果測(cè)定樣品中有胱氨酸結(jié)晶時(shí)，可用離心方法把沉淀物分離。然后向沉淀物中加1mol/LHCl溶液1.0mL，在60℃水浴中保溫15min，使胱氨酸溶解。再離心后，取此上清液與初次離心上清液合并進(jìn)行分析。③巰基的還原反應(yīng)和顯色：上述各管分別加磷鎢酸試劑1.0mL94（八）谷氨酸的測(cè)定：1、原理：L－谷氨酸在大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶作用下脫羧釋放出二氧化碳，用壓法測(cè)得二氧化碳放出量，計(jì)算出谷氨酸含量。2、試劑：大腸桿菌丙酮粉的制備；0.5mol/LpH4.8乙酸鹽緩沖液；20g／L大腸桿菌丙酮粉