聚蔗糖-泛影葡胺分離液在鯽外周血中的應用

聚蔗糖-泛影葡胺分離液在鯽外周血中的應用

隨著海洋動物疾病免疫控制的發(fā)展，魚類免疫機制的研究越來越受到重視。魚類的免疫系統(tǒng)雖不及哺乳動物發(fā)達,但其外周血淋巴細胞也是分成T細胞和B細胞兩大類,淋巴細胞經(jīng)誘導后轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞,隨著形態(tài)的變化,合成并釋放出多種細胞因子和抗體等效應分子以調(diào)控免疫應答的產(chǎn)生。要研究魚類的免疫機制,首先必須從血液或者其他淋巴組織或器官中分離提取足夠數(shù)量、高純度的有活性的淋巴細胞。分離魚類淋巴細胞的方法很多,目前比較常見的是聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque)分層液密度梯度離心法,該法簡單易行,所分離的淋巴細胞的純度、得率和活力都比較高。本試驗即采用此法分離鯽淋巴細胞。1材料和方法1.1高龍飼料水泥池鯽魚(Carassiusauratus),購于信陽南灣水庫水產(chǎn)站,體重300~350g,體長21~26cm,無病無傷,活潑健康。于2m×2m×1m水泥池中飼養(yǎng)一周,每天早晚各投喂一次顆粒飼料(武漢高龍飼料有限公司產(chǎn)品),視水質(zhì)情況換水。確認魚體健康正常后用于試驗。1.2細胞分離液的配制首先通過體積稱量法算出76%泛影葡胺的密度,然后將淋巴細胞分離液和泛影葡胺按照不同體積比混合在一起,配制成密度分別為1.077,1.080,1.083,1.085,1.087,1.090g/mL的淋巴細胞分層液。1.3外周血活檢密度的確定鯽外周血淋巴細胞的分離參照Verburg-vanKemenade等的方法進行,并稍加改進。即取鯽數(shù)尾,干抹布擦干體表,0.1%KMnO4體表消毒后再用75%酒精棉球擦洗,置于超凈工作臺的解剖盤上,用準備有肝素抗凝劑的注射器,從鯽尾動脈中采取外周血,立即取一滴用于淋巴細胞計數(shù),其余用等體積的洗液稀釋一倍,取密度分別為1.077,1.080,1.083,1.085,1.087和1.090g/mL的淋巴細胞分層液各2mL,分別置于10mL已滅菌塑料離心管中,用移液器取稀釋血液4mL,沿管壁緩緩地疊加到淋巴細胞分層液界面上,注意不要破壞分層液界面。用高速冷凍離心機(SIGMA公司產(chǎn)品)水平轉(zhuǎn)頭于20℃,800g,離心20min,用毛細吸管插入分層液與血漿交界部位渾濁的灰白層,沿管壁輕輕吸出灰白層淋巴細胞富集層,放入新的離心管中,用5倍體積洗液重懸洗滌,于4℃,600g,離心10min,再用洗液洗滌2次,棄上清,定量加入RPMI-1640完全培養(yǎng)液2mL,吹打均勻,即成鯽外周血淋巴細胞懸液。1.4細胞計數(shù)1.4.1外周血中細胞計數(shù)tf取10μL鯽外周血加入2mL魚用血細胞稀釋液中,充分混勻,取一滴加入血球計數(shù)板上,顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的淋巴細胞總數(shù),按公式:淋巴細胞密度(個/mL)=4個大方格內(nèi)的淋巴細胞總數(shù)/4×104×200(稀釋倍數(shù))計算外周血中淋巴細胞數(shù)。1.4.2細胞密度和回收率取1滴細胞懸液與1滴0.2%臺盼藍染液混合均勻,5min后,加入血球計數(shù)板上,顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)的淋巴細胞總數(shù),按公式:淋巴細胞密度(個/mL)=4個大方格內(nèi)的淋巴細胞總數(shù)/4×104×2(稀釋倍數(shù))進行計算。淋巴細胞回收率=[所得細胞懸液體積(mL)×懸液中淋巴細胞密度(個/mL)]/[原血液體積(mL)×原血液中淋巴細胞密度(個/mL)]×100%。同時進行細胞活力檢測,死細胞可被染成藍色,活細胞不著色,按公式:活細胞百分率=活細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%,計數(shù)200個淋巴細胞,計算出活細胞的百分率。2結(jié)果與分析2.1細胞回收率及細胞富集層通過比較不同密度淋巴細胞分層液的分離結(jié)果,發(fā)現(xiàn)密度為1.085g/mL的分層液可有效分離出鯽外周血淋巴細胞(表1),離心管內(nèi)液體明顯分成4層,最上層很厚,鮮紅色,為血漿層;第2層較薄,呈灰白色膜狀,即為淋巴細胞富集層;第3層很厚,無色透明,為細胞分層液層;最下層為明顯的壓集紅細胞層,其上有一很薄的白膜層。經(jīng)過9次試驗重復,淋巴細胞回收率為76.21%~93.79%,平均為85.11%;每毫升外周血可獲4.42×106~5.44×106個淋巴細胞,平均為4.88×106個。同時,通過臺盼藍拒染色法檢查所分離細胞的存活率,發(fā)現(xiàn)9次試驗重復的細胞存活率均≥96%(表2)。用密度低于1.085g/mL的淋巴細胞分層液進行淋巴細胞分離,發(fā)現(xiàn)淋巴細胞富集層不明顯,有時看不到淋巴細胞富集層,鏡檢淋巴細胞數(shù)量也很低;而用高于1.085g/mL的淋巴細胞分層液分離淋巴細胞時,發(fā)現(xiàn)淋巴細胞富集層較明顯,鏡檢淋巴細胞數(shù)量也較多,但紅細胞數(shù)量也相應增多,占有相當比例。2.2紅細胞富集層分別觀察血漿層、淋巴細胞富集層、細胞分層液層和紅細胞層所作的涂片,發(fā)現(xiàn)血漿層中含有大量血栓細胞;淋巴細胞富集層中含大量的淋巴細胞、少部分的單核細胞、極少部分的血栓細胞和個別的紅細胞,經(jīng)觀察統(tǒng)計,淋巴細胞占82%~91%,平均為86%,單核細胞占9%~18%,平均為14%;分離液層中無任何細胞;壓積的紅細胞層上為粒細胞層,呈一層很薄的白膜,取樣較難,易將紅細胞吸入。3分離細胞的細胞為了研究魚類淋巴細胞的各項功能,首先必須從魚類外周血或其他組織器官中最大限度地分離出有生命力的淋巴細胞。目前,淋巴細胞分離技術(shù)主要有:稀釋血液離心法、血漿凝膠法、Ficoll-hypaque分層液密度梯度離心法和Percoll密度梯度離心法。具體選擇何種細胞分離技術(shù),首先要看該技術(shù)所分離細胞的純度、得率和活力是否能夠滿足研究需要,同時又要看該技術(shù)是否簡單易行。由于不同種屬的動物其淋巴細胞的大小、密度、表面電荷和粘附能力等均存在著差異,因此,在選擇淋巴細胞分離液時就要注意這些因素的影響,選擇不同密度和特性的分離液。密度為1.077g/mL的細胞分離液(Ficoll-hypaque)是市售的標準淋巴細胞分離液,可有效地分離人的淋巴細胞,但用來分離鯽的淋巴細胞效果較差,為此本研究通過加入不同量的76%泛影葡胺以調(diào)節(jié)密度,發(fā)現(xiàn)在20℃,800g(2310r/min)離心20min的條件下,1.085g/mL的分離液可有效地分離鯽外周血淋巴細胞。與豐培金等報道的鯉(CyprinuscarpioL.)白細胞分離結(jié)果基本一致。但陳全震等認為,自配的相對體積質(zhì)量為1.080~1.085g/mL的Ficoll-Urografin分層液在4000r/min30~60min的條件下,可將草魚(Ctenopharyngodonidella)外周血中淋巴細胞100%地分離出來。二者結(jié)果顯然存在差別,原因可能是由于種屬不同、環(huán)境溫度不同、離心力和離心時間不同及其他一些難以預測的因素等造成分離結(jié)果的很大差別。雖然細胞分離液的密度是影響淋巴細胞有效分離的關(guān)鍵因素,但其他一些因素的影響也是不可忽視的。其中采集足量的外周血液是收集大量淋巴細胞的前提條件,另外離心力、離心時間、環(huán)境溫度、個體差異及血液黏稠度都會影響分離的淋巴細胞數(shù)量和純度。若加大離心力和延長離心時間,雖然有時可以提高淋巴細胞回收率,但勢必會大大降低淋巴細胞的存活率,使紅細胞的脆性發(fā)生改變,造成溶血現(xiàn)象。一般采用600~1000g(相當于2000~2500r/min)離心力、20~25min的離心時間。環(huán)境溫度過高也會嚴重影響淋巴細胞存活率,過低則會影響細胞分離液的分離效果,如Ficoll-hypaque分層液即要求在整個分離過程中,溫度應始終控制在18~28℃之間,以20℃左右最好,否則將影響分離質(zhì)量。血液自身黏稠度很大,為提高淋巴細胞分離效果,分離前將血液進行2