土壤細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

土壤細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

背景介紹土壤是微生物生活的良好環(huán)境

土壤中的生態(tài)環(huán)境條件——營養(yǎng)（有機(jī)質(zhì)豐富）、水分（有一定含量）、空氣（含氧氣）、酸堿度（pH5.5-5.8，適宜）、滲透壓（0.3-0.6MPa，等滲或低滲環(huán)境）、溫度條件（較恒定）和表面保護(hù)層。故土壤是微生物的大本營，也是人類最豐富的“菌種資源庫”。CompanyLogo

土壤中微生物的主要種類有：

細(xì)菌（占70-90％）108

放線菌

107

絲狀菌

106

酵母菌

105

藻類

104

原生動(dòng)物

103土壤中常見微生物類群CompanyLogo不同類型的土壤中微生物的種類和數(shù)量是不相同的。調(diào)查結(jié)果表明，有機(jī)質(zhì)含量豐富的黑土、草甸土、磷質(zhì)石灰土等的微生物數(shù)量多；栗鈣土、鹽堿土、紅壤土、磚紅壤土的微生物數(shù)量較少。不同土層深度的土壤中微生物的數(shù)量和種類也不同。一般土壤表層微生物數(shù)量最多，隨著土層的加深，微生物的數(shù)量逐步減少。土壤中微生物的數(shù)量與分布CompanyLogo土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理介紹實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備操作步驟數(shù)據(jù)處理丟棄處理實(shí)驗(yàn)流程CompanyLogo土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定法

1.原理：

用營養(yǎng)瓊脂傾注平板，測(cè)定被檢物在單位重量或體積（g或ml）內(nèi)所含有的活細(xì)菌數(shù)量，以判明被檢物被細(xì)菌污染的程度。CompanyLogo實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備用途用品取樣無菌鑷子、無菌試劑瓶、無菌水、無菌試管、無菌移液管、吸耳球、天平、鏟子接種培養(yǎng)營養(yǎng)瓊脂平板（滅菌）、培養(yǎng)皿（滅菌）、涂布棒、移液管、吸耳球、75%酒精棉、培養(yǎng)箱其他滅菌鍋、酸度計(jì)、玻璃棒、燒杯、棉塞、蒸餾水、量筒、玻璃珠CompanyLogo實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備每個(gè)平板需培養(yǎng)液20ml，每個(gè)稀釋梯度（至10-7）需要準(zhǔn)備3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算所需材料的量。CompanyLogo操作步驟計(jì)數(shù)報(bào)告接種培養(yǎng)稀釋取樣計(jì)數(shù)報(bào)告接種培養(yǎng)稀釋取樣CompanyLogo1、取土樣選定取樣點(diǎn)，按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2-10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。土樣取回后應(yīng)盡快投入實(shí)驗(yàn)，土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo2、倒平板熔化已滅菌的培養(yǎng)基并冷卻至45℃左右倒平板，凝固待用，每種培養(yǎng)基每個(gè)稀釋度各三只平板。土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo3、編號(hào)取5支無菌空試管（15×150mm）依次編號(hào)為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分裝無菌水按無菌操作用10mL移液管分別吸取9mL無菌水于編號(hào)的各無菌空試管中。土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo5.制備土壤稀釋液稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10-20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液。用無菌移液管吸取懸液1mL于9mL無菌水試管中，用移液管吹吸三次、搖勻，此即為10-3濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進(jìn)行，整個(gè)稀釋過程如圖。土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo充分振搖或研磨25g或25ml檢樣225mL無菌水1：10稀釋液。1ml1ml1ml9ml稀釋液1：1009ml稀釋液1：10009ml稀釋液1：10000操作要求：“無菌操作”貫徹始終。制備土壤稀釋液CompanyLogo6、接種分別精確吸取每個(gè)稀釋度的菌液1mL；對(duì)號(hào)加在已凝固的平板上，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)平行，同時(shí)做空白對(duì)照，空白對(duì)照只加培養(yǎng)基，不接種菌液。土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo7.培養(yǎng)將涂布后的平板上倒置于恒溫箱中，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24-48h,觀察結(jié)果。土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo8.計(jì)數(shù)選菌落分散、菌落數(shù)適量且各平行皿菌落數(shù)接近的稀釋度的平皿計(jì)數(shù)，通常細(xì)菌選取菌落數(shù)在30-300之間的平皿，最后換算成每克土所含菌數(shù)。

每克土含菌數(shù)=同一稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

土壤細(xì)菌總數(shù)測(cè)定流程CompanyLogo

1、平皿分4部分點(diǎn)數(shù)（見圖）

2、求同一稀釋度的平均菌落數(shù)如：A1數(shù)+A2數(shù)

2培養(yǎng)及計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)CompanyLogo培養(yǎng)及計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)計(jì)數(shù)時(shí)間：到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)立即計(jì)數(shù)。如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。計(jì)平皿中菌落數(shù)：肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查。記下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。CompanyLogo規(guī)律：不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個(gè)平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗(yàn)中的差錯(cuò)（有的食品有時(shí)可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。培養(yǎng)及計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)CompanyLogo

當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。

當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時(shí)，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個(gè)菌落計(jì)，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個(gè)菌落計(jì)算，不要把鏈上生長的每一個(gè)菌落分開計(jì)數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。

培養(yǎng)及計(jì)數(shù)注意事項(xiàng)CompanyLogo計(jì)數(shù)原則計(jì)數(shù)原則：選平均菌落數(shù)在30-300之間者進(jìn)行計(jì)算2.若有2個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間時(shí)，則按兩者的菌落總數(shù)之比來決定，若比值小于2應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的菌落總數(shù)。1.僅1個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報(bào)告之。CompanyLogo4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。計(jì)數(shù)原則CompanyLogo7.在求同稀釋度的平均數(shù)時(shí)，若其中1個(gè)平板上有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計(jì)數(shù)，然后乘以2作為整個(gè)平板的菌落數(shù)。6.若所有的菌落數(shù)勻?yàn)椤盁o法計(jì)數(shù)”時(shí)，應(yīng)注明水樣的最大稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)原則CompanyLogo例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落數(shù)(個(gè)/mL)報(bào)告方式(個(gè)/mL)10-110-210-31136516420—1640016000或1.6×10422760295461.63775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044無法計(jì)數(shù)4650513—513000510000或5.1×105527115—270270或2.7×1026無法計(jì)數(shù)30512—3050031000或3.1×1047無法計(jì)數(shù)無法計(jì)數(shù)無法計(jì)數(shù)—10-3無法計(jì)數(shù)報(bào)告原則CompanyLogo菌落總數(shù)報(bào)告方式

菌落數(shù)的報(bào)告，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定菌落數(shù)在1-100時(shí)，按實(shí)有數(shù)字報(bào)告，如大于100時(shí)，則報(bào)告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零位，可用10的指數(shù)來表示。

固體檢樣以克（g)為單位報(bào)告，液體檢樣以毫升（mL）為單位報(bào)告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報(bào)告。CompanyLogo菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告:

菌落數(shù)報(bào)告結(jié)果1、30~300之間平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)

2、求比值>2取較小稀釋倍數(shù)在30~300之間<2取平均數(shù)3、>300最高稀釋度平均菌落數(shù)X最高稀釋倍數(shù)4、<30最低稀釋菌度平均落數(shù)X最低稀釋倍數(shù)5、>300<306、無法計(jì)數(shù)報(bào)告無法計(jì)數(shù)取最接近的X稀釋倍數(shù)(若有兩個(gè)稀釋度)CompanyLogo實(shí)驗(yàn)流程填寫項(xiàng)目單