《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件

基因芯片技術(shù)Genechiptechnology基因芯片技術(shù)Genechiptechnology1內(nèi)容提要：第一節(jié)差異表達(dá)基因分析第二節(jié)聚類分析第三節(jié)主成分分析第8章利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析內(nèi)容提要：第8章利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析2第一節(jié)差異表達(dá)基因分析

第一節(jié)差異表達(dá)基因分析3單張cDNA芯片差異表達(dá)基因Aerobic需氧Anaerobic不需氧單張cDNA芯片差異表達(dá)基因Aerobic需氧4差異表達(dá)基因分析基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)的主要目的之一是發(fā)現(xiàn)兩個樣本間差異表達(dá)基因。通常采用基因在實(shí)驗(yàn)組和對照組中信號的比值作為衡量基因在兩種狀態(tài)下基因的表達(dá)差異。在雙色熒光系統(tǒng)中，用Cy5/Cy3的比值來衡量基因的表達(dá)差異，也稱表達(dá)差異值。差異表達(dá)基因分析基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)的主要目的之一是發(fā)現(xiàn)兩個樣5差異表達(dá)基因分析在Affymetrix等短的寡核苷酸芯片中，采用單色熒光標(biāo)記的方式，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別用兩張芯片進(jìn)行檢測，表達(dá)差異值即為兩張芯片的信號比值。噪聲和芯片本身的一些因素以及生物學(xué)本身的特點(diǎn)給篩選差異表達(dá)基因帶來了很大的麻煩。必須設(shè)定一個差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)。這個篩選的標(biāo)準(zhǔn)就稱為差異表達(dá)基因的閾值。

差異表達(dá)基因分析在Affymetrix等短的寡核苷酸芯片中，6如何確定差異表達(dá)基因的閾值

倍數(shù)法優(yōu)點(diǎn)：簡單、直接。缺點(diǎn)：沒有考慮差異表達(dá)的統(tǒng)計顯著性。比如，在某個實(shí)驗(yàn)中，基因表達(dá)水平的變化不大，如果選擇判別域值為2倍，則有可能找不到幾個差異表達(dá)的基因，假陰性率比較高。但如果是主觀縮小判斷域值，又有可能增大假陽性率。

如何確定差異表達(dá)基因的閾值

倍數(shù)法優(yōu)點(diǎn)：簡單、直接。7Z值法

在一張cDNA芯片上一般都點(diǎn)了很多基因，其實(shí)這些基因中只有一小部分表達(dá)有差異，所以一般都假設(shè)表達(dá)的比率值滿足正態(tài)分布。Z=(X-μ)/σ.|Z|>=1.96在寡核苷酸芯片中，芯片上的基因在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下或相應(yīng)組織中也只有一小部分基因有表達(dá)，可以假定強(qiáng)度滿足對數(shù)正態(tài)分布，同樣可以對其作Z變換，使其具有統(tǒng)計意義。Z值法在一張cDNA芯片上一般都點(diǎn)了很多基因，其實(shí)這些基因8Z值法

缺點(diǎn)：如果實(shí)驗(yàn)體系中沒有一條差異表達(dá)的基因，Z值法還是會挑選出5％的差異表達(dá)基因。這是因?yàn)樵谛酒瑢?shí)驗(yàn)中，總有一些由于背景噪聲產(chǎn)生的假陽性點(diǎn)。如果實(shí)際上實(shí)驗(yàn)中有大量的基因表達(dá)發(fā)生改變，Z值法還是機(jī)械的找出5％的差異表達(dá)基因，丟失了一部分真陽性點(diǎn)。Z值法缺點(diǎn)：9排秩統(tǒng)計量法選擇一個統(tǒng)計量給基因排秩（研究多，方法多）為排秩統(tǒng)計量選擇一個閾值，在閾值之上的值將被認(rèn)為是表達(dá)差異顯著的值排秩統(tǒng)計量法選擇一個統(tǒng)計量給基因排秩（研究多，方法多）10重復(fù)芯片（replicates）M值法根據(jù)比率平均值或M值對基因排序。M值為信號強(qiáng)度比值的log2值，M杠是任一特定基因在重復(fù)序列中M值的均值。缺點(diǎn)：這一排序法忽略了一個基因在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的不同芯片上表達(dá)水平的差異程度。例如，可能某一個基因在某一張芯片上M值很大，但在其他芯片上M值很小，其實(shí)這條基因并沒有差異表達(dá)，但由于個別M值的影響，從而顯示出一個差異表達(dá)的特性，造成假陽性。重復(fù)芯片（replicates）M值法根據(jù)比率平均值或M值對11T值排序假如一個基因在幾張重復(fù)芯片的M值都很小，但是這些M值非常接近，所以s值也非常小，這樣可能會導(dǎo)致t值很大，從而會把這個本沒有差異表達(dá)的基因誤認(rèn)為差異表達(dá)。T值排序假如一個基因在幾張重復(fù)芯片的M值都很小，但是這些M值12修正的T值法修正值由樣本方差的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差估計而得。結(jié)果顯示：在一個模擬的數(shù)據(jù)集中，雖然帶有一些經(jīng)驗(yàn)性質(zhì)，但用修正t-統(tǒng)計量給基因排秩比用均數(shù)和一般的t-統(tǒng)計量效果要好。修正的T值法修正值由樣本方差的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差估計而得。結(jié)果顯示13單通道寡核苷酸芯片差異基因（兩個樣本直接比較）Affymetrix，illumina芯片由于有探針重復(fù)，可以利用統(tǒng)計方法計算出一個統(tǒng)計性的P值或者score值，篩選差異表達(dá)基因。單通道寡核苷酸芯片差異基因（兩個樣本直接比較）Affymet14不同類樣本差異基因識別不同類樣本差異基因識別15評價一組數(shù)的統(tǒng)計量平均值標(biāo)準(zhǔn)差評價一組數(shù)的統(tǒng)計量平均值標(biāo)準(zhǔn)差16比較多組數(shù)的方法T檢驗(yàn)：平均值F檢驗(yàn)：方差比較多組數(shù)的方法T檢驗(yàn)：平均值17《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件18《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件19SAM（significanceanalysisofmicroarrays）

微陣列顯著性分析

在單通道Oligo芯片中，尤其是affymetrix芯片數(shù)據(jù)分析中用得較多SAM（significanceanalysisofm20《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件21雙通道cDNA芯片數(shù)據(jù)分析用得較多雙通道cDNA芯片數(shù)據(jù)分析用得較多22FalseDiscoveryRate(FDR)錯誤發(fā)現(xiàn)率統(tǒng)計學(xué)家都想用更符合統(tǒng)計學(xué)的手段得到差異基因，即通過假設(shè)檢驗(yàn)后，賦予每個基因統(tǒng)計顯著性或者P值，使得每個基因的判別更有統(tǒng)計學(xué)上的意義。為了達(dá)到這個目的，統(tǒng)計學(xué)家們常常用控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FalseDiscoveryRate）的方法來判斷差異基因。錯誤發(fā)現(xiàn)率是評估檢驗(yàn)統(tǒng)計顯著性的最有力工具之一。FalseDiscoveryRate(FDR)錯誤發(fā)現(xiàn)23Multipletest(P-valueadjustment)

多重檢驗(yàn)（P-價值判斷）Multipletest(P-valueadjustm24火山圖（volcanoplot）Statisticaltest:P-value（統(tǒng)計檢驗(yàn)：P值）Foldchange:Ratio（折疊變換：比率）火山圖（volcanoplot）Statisticalt25其他方法B-statistics(Smyth,2004)BayesT-test(BaldiandLong,2001)SAMROC(Broberg,2002)Zhao-Panmethod(ZhaoandPan,2003)……其他方法B-statistics(Smyth,2004)26ImprovedDetectionofDifferentiallyExpressedGenes對差異表達(dá)基因的改良性觀測

Timeseriesmicroarraydataset微陣列數(shù)據(jù)的時間序列ImprovedDetectionofDifferen27聚類：發(fā)現(xiàn)一些未知的細(xì)胞狀態(tài)、疾病的亞型以及一些能識別這些樣本狀態(tài)的基因，或者說發(fā)現(xiàn)一類功能相似的基因或者一類有共同調(diào)控機(jī)制的基因。歸類（分類）：基于已有知識，并有改進(jìn)現(xiàn)有知識的潛力，通過訓(xùn)練分類器來辨識與已知細(xì)胞狀態(tài)或疾病亞型相類似的樣本，或者是與已知的共調(diào)控基因表達(dá)相似的基因。第二節(jié)基因芯片聚類分析

聚類：發(fā)現(xiàn)一些未知的細(xì)胞狀態(tài)、疾病的亞型以及一些能識別這些樣28分類(classification)分類(classification)29《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件30分類(classification)樣本分類情況已知分類基因選取分類準(zhǔn)確性判斷：準(zhǔn)確率，相關(guān)性分類(classification)樣本分類情況已知31層級聚類方法：得到類似于進(jìn)化分析的系統(tǒng)樹圖，具有相似表達(dá)譜的基因彼此臨近，他們可能具有相似的功能。其重要思想是：先將n個樣本看成n類，計算類間的距離，再將相似性最高的兩類合并成為一個新類，得到n-1類，再重新計算關(guān)系矩陣，不斷重復(fù)這個過程直至所有的基因融合成為一個層級聚類方法：得到類似于進(jìn)化分析的系統(tǒng)樹圖，具有相似表達(dá)譜的32基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣

(AffymetrixGeneChip?oligonucleotidearrays)GeneexpressiontableX：logsam/refintensitiesX＞0:geneisoverexpressedX＜0:geneisunderexpressed基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣(AffymetrixGeneChip?33基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣(glassslides)GeneexpressiontableX：logred/greenintensitiesX＞0:geneisoverexpressedX＜0:geneisunderexpressed基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣(glassslides)Geneex34數(shù)據(jù)矩陣具體形式數(shù)據(jù)矩陣具體形式35數(shù)據(jù)形式對任意一個基因來說，樣本值是特征值，數(shù)據(jù)的維數(shù)是M對任意一個樣本來說，基因值是特征值，數(shù)據(jù)的維數(shù)是N數(shù)據(jù)矩陣,基因數(shù)遠(yuǎn)大于樣品數(shù)。聚類時，考查基因間的相似性，從數(shù)學(xué)上講就是看對應(yīng)的M維數(shù)據(jù)之間的相似性。數(shù)據(jù)形式對任意一個基因來說，樣本值是特征值，數(shù)據(jù)的維數(shù)是M數(shù)36Cluster&Treeview軟件Cluster&Treeview軟件37Cluster&Treeview軟件Cluster&Treeview軟件38Genesis軟件Genesis軟件39預(yù)分析（Pre-Analysis）重復(fù)值合并（replicatehandling）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和標(biāo)準(zhǔn)化（datatransformationandstandardization）缺失數(shù)據(jù)處理（missingvaluemanagement）基因篩選（patternselection）預(yù)分析（Pre-Analysis）重復(fù)值合并（replic40重復(fù)值合并在特定條件下把所有的重復(fù)值合并成一個數(shù)值可能更為方便，而這一個值是給定基因/條件的代表。通常的合并：計算這些重復(fù)值的集中趨勢指標(biāo)，如均數(shù)、中位數(shù)或眾數(shù)。但是，使用一個集中趨勢指標(biāo)代替一組數(shù)值意味著信息的丟失，因此數(shù)據(jù)的合并應(yīng)謹(jǐn)慎。去除奇異值：可以通過計算原始數(shù)據(jù)的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，去除位于給定區(qū)間外的數(shù)據(jù)（如均數(shù)加減3個標(biāo)準(zhǔn)差外的數(shù)據(jù)）。剩余的數(shù)據(jù)重新計算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并消除給定區(qū)間外的數(shù)據(jù)。重復(fù)值合并在特定條件下把所有的重復(fù)值合并成一個數(shù)值可能更為方41重復(fù)值合并：

重復(fù)值合并：

42數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)變換的目的：在盡量保證原始數(shù)據(jù)特征不變的前提下，使變換后的數(shù)據(jù)更適于進(jìn)行統(tǒng)計分析。對數(shù)轉(zhuǎn)化（log-transformation）中心化處理（center）單位圓化正態(tài)化（均值為0，方差為1）數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)變換的目的：在盡量保證原始數(shù)據(jù)特征不變的43缺失數(shù)據(jù)處理芯片上的某些點(diǎn)可能因?yàn)樾酒娜毕?、點(diǎn)像素強(qiáng)度達(dá)到飽和、點(diǎn)像素強(qiáng)度非常小等因素而產(chǎn)生異常的數(shù)據(jù)點(diǎn)，在數(shù)據(jù)的預(yù)處理階段把這些數(shù)據(jù)點(diǎn)刪除。未觀測點(diǎn)若后續(xù)的統(tǒng)計分析要求數(shù)據(jù)滿足完整性，如特征基因提取的奇異值分解、某些基因的聚類分析方法等，則需要對含有缺失值的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理刪除含有缺失值的整條記錄，這種方法操作簡單，但卻因?yàn)閭€別值的缺失而刪除整個記錄，可能丟失大量有價值的信息填充或修補(bǔ)缺失數(shù)據(jù)缺失數(shù)據(jù)處理芯片上的某些點(diǎn)可能因?yàn)樾酒娜毕?、點(diǎn)像素強(qiáng)度達(dá)到44缺失數(shù)據(jù)的處理固定值法，比如0或者1行平均法使用重復(fù)數(shù)據(jù)點(diǎn)對缺失數(shù)據(jù)進(jìn)行填充。對于生物學(xué)重復(fù)中缺失數(shù)據(jù)的填充應(yīng)慎重，應(yīng)當(dāng)使用盡量同質(zhì)的樣品對缺失值進(jìn)行估計。使用基因間的相關(guān)性對缺失數(shù)據(jù)進(jìn)行填充。奇異值分解法，KNN法。其他方法，最小二乘法擬合修補(bǔ)，方差迭代分析，最大可能性分析缺失數(shù)據(jù)的處理固定值法，比如0或者145缺失數(shù)據(jù)的處理方法——KNN法K最近鄰法（K-nearestneighborhoodmethod）：假定某個基因在某個指標(biāo)上含有缺失值，計算含缺失值的基因與在該指標(biāo)上無缺失的基因間的相似性指標(biāo)。與該基因相似性最大的K個基因稱為該基因的K個最近鄰，這K個基因在該指標(biāo)上的數(shù)據(jù)就是估計該基因缺失數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)，估計值可以是這K個基因在該指標(biāo)上的均數(shù)，也可以是這K個基因的加權(quán)均數(shù)。在加權(quán)均數(shù)中，權(quán)重為上面計算的基因間的相似性。K值的確定具有一定的經(jīng)驗(yàn)性，但不宜太大和太小。

缺失數(shù)據(jù)的處理方法——KNN法K最近鄰法（K-nearest46《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件47基因篩選（geneselection）在進(jìn)行分析之前，要先選擇用來分析的基因。芯片中的基因有上萬條，相應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣也有上萬行時，要預(yù)先進(jìn)行基因的濾取，否則既會增加運(yùn)算的難度，又會引入了不必要的基因，更增加了解釋結(jié)果的難度。去掉無效基因，當(dāng)某條基因在表達(dá)譜數(shù)據(jù)中的無效數(shù)據(jù)個數(shù)超過一定范圍時，該基因就被認(rèn)為是一條無效基因，在聚類分析中不考慮該基因。一條基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的波動很小，即數(shù)據(jù)的方差小于一定范圍，意味著這條基因與所要研究的生物過程或?qū)ο箨P(guān)聯(lián)很小，也可濾掉。基因篩選（geneselection）在進(jìn)行分析之前，要先48基因篩選針對特別目的的基因篩選，如篩選不同類之間差異表達(dá)基因，常用假設(shè)檢驗(yàn)的方法，比如t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)等?；蚝Y選針對特別目的的基因篩選，如篩選不同類之間差異表達(dá)基因49發(fā)展新算法新角度合并多種方法發(fā)展新算法新角度合并多種方法50第三節(jié)主成分分析

（PrincipleComponentAnalysis，PCA）不改變整體數(shù)據(jù)矩陣的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，去除數(shù)據(jù)的冗余性，常用主成分分析法。第三節(jié)主成分分析

（PrincipleComponen51降維概述降維：指將樣本從輸入空間通過線性或非線性映射到一個低維空間。降維：將高維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為易于處理的低維數(shù)據(jù)，減少了無用信息和冗余信息，減少了后續(xù)的計算量。當(dāng)降至三維以下時，可以使用可視化技術(shù)，從而發(fā)揮人在低維空間感知上的優(yōu)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的空間分布、聚類性質(zhì)等結(jié)構(gòu)特征。降維概述降維：指將樣本從輸入空間通過線性或非線性映射到一個低52主成分分析（PCA，principalcomponentanalysis）

對于一組原始隨機(jī)變量為X1,…,Xp，尋找一個新的變量Z1，這個新的變量是原始變量的線性組合，Z1=a11X1+a21X2+…+ap1Xp，并使得Z1的變異最大化Z1即為原始變量的最大主成分，它使用一個變量試圖最大化地包含一組變量的變異。通常一個變量還不足夠，因此，需要尋找第二個主成分Z2，Z2與Z1不相關(guān)，且是除Z1外具有最大方差的原始變量的線性組合。主成分分析（PCA，principalcomponent53主成分分析主成分分析54《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課件55《基因芯片技術(shù)》第8章-利用基因芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析課