熒光技術(shù)與生命科學(xué)

熒光技術(shù)與生命科學(xué)專家簡(jiǎn)介：阮康成中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所副所長(zhǎng)、研究員、博士生導(dǎo)師，中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)，上海市政協(xié)科教文衛(wèi)體專業(yè)委員會(huì)副主任，九三學(xué)社上海市委科技工作委員會(huì)主任。專家簡(jiǎn)介：阮康成中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所副所長(zhǎng)、研究員、博士生導(dǎo)師，中國(guó)生物物理學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)，上海市政協(xié)科教文衛(wèi)體專業(yè)委員會(huì)副主任，九三學(xué)社上海市委科技工作委員會(huì)主任。1969年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，1981年中科院上海生化所研究生畢業(yè)。阮康成：我今天要講的熒光光譜學(xué)和生命科學(xué)。生命科學(xué)這幾年非常熱門，其原因無(wú)非是這幾條，一、它是既老又很年輕的科學(xué)，生命科學(xué)還有很多奧秘沒(méi)有被揭開(kāi)，隨著社會(huì)的發(fā)展，生命科學(xué)的很多問(wèn)題被揭示了，所以人們對(duì)它產(chǎn)生了興趣；二、生命科學(xué)與人類的健康、壽命是緊密相關(guān)的。人類對(duì)生命科學(xué)巨大的成就，比如說(shuō)人類基因組、還有一些重大疾病的揭示都比較了解了，但是我看了以前的科普?qǐng)?bào)告，對(duì)生命科學(xué)是如何做的，用了其它學(xué)科的什么方法，什么技術(shù)來(lái)做這方面講的不多。所以，我今天想結(jié)合我自己的研究，給大家介紹生命科學(xué)中如何用到熒光技術(shù)。我們這里講的熒光與日常生活中看到的、遇到的熒光是不完全一個(gè)概念。首先我們看湖南衛(wèi)視《超級(jí)女生》視頻，臺(tái)下觀眾手中揮舞的熒光棒，還有大家所熟知的螢火蟲(chóng)發(fā)的熒光，還有節(jié)能燈發(fā)出的熒光，這是平時(shí)一般意義上的熒光，與我們現(xiàn)在所講的熒光是不完全一樣的。生命科學(xué)中所講的熒光是指當(dāng)用一定波長(zhǎng)的光去照射熒光物質(zhì)時(shí)，或者用我們的話來(lái)說(shuō)去激發(fā)這個(gè)熒光物質(zhì)時(shí)，這個(gè)物質(zhì)就會(huì)發(fā)出與激發(fā)光顏色不同的光，我們把這種光叫熒光。而且有個(gè)特點(diǎn)：這個(gè)物質(zhì)發(fā)出的光的顏色用波長(zhǎng)來(lái)講，要比激發(fā)它的光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)，這就是生命科學(xué)中用的真正的熒光。而剛才前面所講的螢火蟲(chóng)等發(fā)出的光，我們稱為生物發(fā)光，而熒光棒發(fā)出的熒光，我們稱為是化學(xué)發(fā)光，兩者概念是不一樣的。講到熒光，首先要回顧一下它的發(fā)展史。我們講的熒光早在十六世紀(jì)就在一種螢石的石頭上被人們發(fā)現(xiàn)了，螢石也就是氟化鈣，當(dāng)光照射到石頭上時(shí)它會(huì)發(fā)出綠色的光，因?yàn)槲炇挠⒄Z(yǔ)是fluorite，因此當(dāng)時(shí)英文把它改為fluorescence，就是熒光。我覺(jué)得，我們中文翻譯的非常確切的。因?yàn)槲乙矝](méi)有考古過(guò)，所以，不知道我國(guó)是從什么時(shí)候開(kāi)始叫螢石的。有人講我國(guó)古代的夜明珠就是螢石，到底是不是，我不知道，一會(huì)我講熒光機(jī)制的時(shí)候，大家可以有個(gè)判斷。螢石在裝飾品工藝上用的很多。直至19世紀(jì)五十年代，由英國(guó)皇家學(xué)會(huì)的Stock院士才真正闡述清楚熒光是怎樣發(fā)生的。他做了一個(gè)非常漂亮的實(shí)驗(yàn)，大家都知道金雞納霜里的有效成分是硫酸奎寧，他把硫酸奎寧溶解在稀硫酸里，放到一個(gè)瓶子里，然后用太陽(yáng)光來(lái)照這個(gè)溶液，但不是直接照射，而是在當(dāng)中用一塊教堂窗上藍(lán)色的玻璃（能透過(guò)400毫微米以下的短波長(zhǎng)的光一一紫外光），也就是說(shuō)，用太陽(yáng)光中的紫外光或者近紫外光來(lái)照射奎寧硫酸溶液，中間還放置一個(gè)黃色的葡萄酒，這杯酒起到的作用是能把400毫微米以上的光都濾掉，只允許400毫微米以上的光透過(guò)，他就在90度的角度上來(lái)觀察，這樣他就能很清楚地看到，奎寧在用400毫微米以下的光照射時(shí)，或者講在激發(fā)時(shí)，發(fā)出的是藍(lán)色的光，藍(lán)色光的波長(zhǎng)要比紫外光的波長(zhǎng)長(zhǎng)。因此Stock就第一個(gè)把熒光發(fā)生的過(guò)程的道理很清楚的講出來(lái)了，而且發(fā)射波長(zhǎng)要比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)，我們把波長(zhǎng)之間的差叫作Sock位移（Sockshift），以次紀(jì)念他的貢獻(xiàn)。實(shí)際上這個(gè)裝置就是最最原始的熒光儀器。用我們現(xiàn)在時(shí)髦的話來(lái)講，這就是原始創(chuàng)新。到了二十世紀(jì)，隨著人們對(duì)量子電子學(xué)的了解，人們對(duì)熒光產(chǎn)生的機(jī)理就更加清楚了。熒光到底是如何產(chǎn)生的呢？從量子電子角度來(lái)講，對(duì)能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)，其分子里的電子在一般情況下是處在基態(tài)，或者說(shuō)穩(wěn)定狀態(tài)（非激發(fā)狀態(tài)），當(dāng)用一定波長(zhǎng)的光（不同物質(zhì)需要不同的光），來(lái)照射熒光分子時(shí)，處于基態(tài)的電子就被激發(fā)到比較高的能級(jí)上去，這個(gè)時(shí)間是非?？斓模蟾旁?0-15秒，比微微秒還要快1000倍的速度。基態(tài)的電子就被激發(fā)上去了，激發(fā)上去的電子很快要回到第一單行激發(fā)態(tài)，這個(gè)時(shí)間需要10-10-10-11秒，然后所有的電子都會(huì)回到第一單線激發(fā)態(tài)的最低能級(jí)，這個(gè)時(shí)候電子就面臨這幾種不同的命運(yùn)：一種是無(wú)功而反，另一種是它從單線態(tài)到三重態(tài)，又可以回到基態(tài)，這個(gè)時(shí)候發(fā)出的光我們叫做磷光。我們所感興趣的第三部分的電子，它是通過(guò)發(fā)光的方法回到基態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)，這個(gè)就是我們感興趣的熒光。因?yàn)槎紡倪@兒起始后回到不同的能級(jí)，它的能量是不一樣的，我們知道能量不一樣，波長(zhǎng)就不一樣。光子的能量是波長(zhǎng)越長(zhǎng)能量越小，反之波長(zhǎng)越短能量越強(qiáng)，所以說(shuō)熒光的波長(zhǎng)肯定要比發(fā)射光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)。我這里要埋下一個(gè)伏筆，熒光的發(fā)射時(shí)間，準(zhǔn)確的講叫熒光壽命，它只是在10-9-10-7秒，現(xiàn)在找到熒光是這樣產(chǎn)生的。熒光中有很多重要的熒光參數(shù)和概念，包括熒光強(qiáng)度、熒光激發(fā)譜和發(fā)射譜、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振、熒光淬滅、能量轉(zhuǎn)移、熒光總量、譜寬、Stock’s位移等，由于我們不是作學(xué)術(shù)報(bào)告，所以不做深入講解了。我們知道了熒光是怎么產(chǎn)生的，那么什么樣的物質(zhì)有熒光呢？我們知道生物大分子有三類，蛋白質(zhì)、核酸、生物膜。據(jù)我所知，核酸里面有些核甘酸是有熒光的，但是其熒光非常非常弱，所以，一般不去做核酸的熒光。生物膜也是如此。在生物學(xué)里，蛋白質(zhì)的組成部分非常有意思，常見(jiàn)的蛋白質(zhì)有20種氨基酸通過(guò)一定的方式組成，其中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，能產(chǎn)生熒光。從它們的分子式里看出，這三種氨基酸都有苯環(huán)，它們各有各的特征。酪氨酸常常做無(wú)名英雄，它單獨(dú)存在或者以氨基酸存在的時(shí)候，它的熒光發(fā)射能力要比色氨酸強(qiáng)的多，但在蛋白質(zhì)里同時(shí)有色氨酸和酪氨酸時(shí)，酪氨酸就變成了"無(wú)名英雄”，它的熒光就不出來(lái)了，只有色氨酸能發(fā)處熒光。圖中，人的血清白蛋白中只有1個(gè)色氨酸，有16個(gè)酪氨酸，照例講，發(fā)熒光應(yīng)該以酪氨酸為主，色氨酸為次，其實(shí)不然，只能測(cè)出色氨酸的熒光。我們把生物中諸如蛋白質(zhì)這種本身就能發(fā)出熒光的物質(zhì)叫做內(nèi)源熒光，色氨酸處于蛋白質(zhì)的位置不同，產(chǎn)生的熒光光譜也是不同的。就此，我們把色氨酸作為報(bào)告基團(tuán)，你有什么樣的光譜反過(guò)來(lái)我們就知道色氨酸處于什么位置，因此我們?cè)谏飳W(xué)中就把熒光發(fā)生團(tuán)叫做探針，也叫報(bào)告基團(tuán)。這樣的色氨酸就可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)的折疊和去折疊。蛋白質(zhì)是由許多氨基酸組成的一條長(zhǎng)鏈，如果它處于無(wú)規(guī)則狀態(tài)下，它是不具有任何功能的，它只有通過(guò)一系列的變化，在高級(jí)結(jié)構(gòu)下才具有它的功能。我們把這個(gè)過(guò)程叫做折疊，因此，我們可以用這樣的方法來(lái)研究它。比方說(shuō)有一種叫33K的蛋白（因?yàn)樗姆肿恿渴?3K），這個(gè)蛋白對(duì)植物光合作用的電子傳遞的穩(wěn)定性起到非常大的作用，33K蛋白里面恰恰只有一個(gè)色氨酸，便于我們研究。所以我們通過(guò)一定的物理化學(xué)方法讓它的色氨酸從里面慢慢地跑到外面來(lái)，這就是用生物學(xué)的解折疊的方法使其中唯一的色氨酸融解到水溶液當(dāng)中去，變換它的光譜并還原，就可以探測(cè)到這個(gè)色氨酸是如何解折疊的。再比如人體內(nèi)的鈣條蛋白，它對(duì)運(yùn)輸鈣離子起重要作用，這個(gè)蛋白質(zhì)里一個(gè)色氨酸都沒(méi)有，但它有四個(gè)鈣離子結(jié)合的部位，我們?cè)诿恳粋€(gè)結(jié)合部位把氨基酸換成色氨酸，每次換一個(gè)，其余三個(gè)保持原狀，從而測(cè)出鈣離子的四個(gè)結(jié)合部位蛋白中的特點(diǎn)。剛才我們簡(jiǎn)單的講了講上帝給我們的色氨酸研究蛋白的方法。測(cè)熒光一定要有儀器，剛才我們講的Stock發(fā)明的是第一臺(tái)最原始的儀器，我們現(xiàn)在用山燈代替太陽(yáng)，山燈會(huì)發(fā)出非常強(qiáng)大的寬光譜光源，然后通過(guò)一個(gè)單色儀，把山燈發(fā)出的光分成一束一束的單色光。這里的山燈就好比是太陽(yáng)，而單色儀就好比是教堂的玻璃片?，F(xiàn)在雖然儀器現(xiàn)代化了，但還是脫離不了Stock設(shè)計(jì)的模式，只不過(guò)裝置復(fù)雜了一點(diǎn)。這里我特別要介紹一位先生：美國(guó)科學(xué)院院士、阿根廷人Dr.GregorioWeber，他是發(fā)現(xiàn)色氨酸中有熒光的第一人。他和我們所原來(lái)的副所長(zhǎng)曹天欽先生是劍橋大學(xué)的同學(xué)，他有一句話說(shuō)得非常好，他認(rèn)為你能用好的儀器出好文章和成果，當(dāng)然是好事情，但是你單單靠好儀器，那不是真正的成就。如果你能用一般的儀器做不是最先進(jìn)儀器，研究出漂亮成果的，那才是真正的成就。說(shuō)到這里讓我聯(lián)想到，我們國(guó)家有時(shí)不計(jì)成本進(jìn)口儀器的事，曾經(jīng)發(fā)生過(guò)有一種儀器全球只生產(chǎn)了5——6臺(tái)，而我們國(guó)家卻占了一半。國(guó)外科學(xué)家到我國(guó)一看，感到吃驚，你們的儀器那么好，但工作卻不是這樣。這是題外話。剛才我們講的是用蛋白質(zhì)本身的熒光來(lái)研究它的功能，它的構(gòu)象，這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，所以在生命科學(xué)研究中人們想出了個(gè)辦法，不單單用本身固有的，還可以用外來(lái)的，進(jìn)行創(chuàng)造性的工作。比如人體本身具有血紅蛋白，它可以把肺里的氧氣傳輸?shù)缴眢w各個(gè)部位。從分子結(jié)構(gòu)上來(lái)講，正常人的血紅蛋白有兩個(gè)a亞基和兩個(gè)R亞基，但如果是血紅蛋白分子病的人，那么，他的R亞基里的氨基酸發(fā)生突變，由谷氨酸變成纈氨酸，非洲人得這種鐮刀型血紅蛋白癥比較多，得了這種病以后，其紅細(xì)胞形狀改變成鐮刀狀，一般只能活到30歲左右。這種病我們國(guó)家還沒(méi)有發(fā)生。下面這個(gè)例子就發(fā)生在上海的，這種病不是R亞基出問(wèn)題，而是其a亞基出現(xiàn)問(wèn)題，其中第87號(hào)氨基酸（我們稱為組胺酸）變成了酪安酸，從而該病人的血紅蛋白攜氧能力就很弱，其病癥是嘴唇發(fā)紫、指甲發(fā)青。我們知道了這個(gè)病人的病理情況，即他這個(gè)氨基酸取代了，那么為什么一個(gè)氨基酸被取代會(huì)發(fā)生這樣的情況呢？我們就設(shè)想是不是其鐵普林出了問(wèn)題，因?yàn)檎嬲龓а醯氖氰F普林中的鐵離子的一個(gè)配位鍵，所以我們嘗試放入外源的1,8ANS熒光探針，其實(shí)它就是我們通常使用的樟腦丸一一奈的一種衍生物，這個(gè)探針專門結(jié)合到蛋白的"疏水部分”。1,8ANS探針有個(gè)特性，它的熒光特性與環(huán)境息息相關(guān)，比如熒光壽命，隨著疏水性能的增強(qiáng)而增強(qiáng)。所以，我們可以倒過(guò)來(lái)通過(guò)測(cè)其熒光壽命來(lái)反推它的疏水特性。另一個(gè)是產(chǎn)生熒光的本領(lǐng)，本領(lǐng)越強(qiáng)，熒光越強(qiáng)。我們想辦法把四個(gè)亞基分開(kāi)，然后用生化的方法非常溫和地把鐵普林拿走，得到?jīng)]有輔基的蛋白亞基，從而測(cè)出是否得病。正常人的熒光壽命為12.9ns相當(dāng)于在辛醇中的壽命，而得病的人為8.0ns相當(dāng)于在乙醇中的壽命，那么顯然得病的人其疏水能力比正常人弱的多，所以攜氧的能力就弱。再舉一個(gè)用外源熒光探針來(lái)研究生物大分子的例子，人們?cè)缇椭烙幸环N生物大分子叫ATP合成酶，它會(huì)轉(zhuǎn)動(dòng)，像一個(gè)不知疲倦的馬達(dá)，之前始終沒(méi)有確切的證據(jù)來(lái)證實(shí)其旋轉(zhuǎn)的特性，直到前幾年有人利用外源熒光探針來(lái)揭示其馬達(dá)的特性。他把酶的上半部分固定到玻璃片上，把它的亞基連上一根肌動(dòng)蛋白組成的非常細(xì)的纖維，標(biāo)上熒光探針，在顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一加ATP時(shí)，它就轉(zhuǎn)動(dòng)了，當(dāng)ATP用完，它也就不轉(zhuǎn)了，如果再加ATP的話，它又會(huì)轉(zhuǎn)。這就是真正的一個(gè)分子的ATP酶轉(zhuǎn)動(dòng)的情況，從而看出熒光方法的優(yōu)勢(shì)。這是一個(gè)模型，我們知道人的肌肉的收縮主要由兩大部分組成：一、肌動(dòng)蛋白組成一個(gè)纖維，二、肌球蛋白，通過(guò)這兩個(gè)蛋白的配合，一動(dòng)一動(dòng)肌肉就收縮了。這里也有用熒光技術(shù)的。下面講一下非常有趣的綠色熒光蛋白，這個(gè)蛋白除了有色氨酸、纈氨酸外，還自身特別形成了一個(gè)發(fā)射團(tuán)，這個(gè)蛋白來(lái)自于海水中的水母，其中有三個(gè)氨基酸，通過(guò)氧化以后形成這樣一個(gè)發(fā)射團(tuán)，這是它的結(jié)構(gòu)示意圖，猶如一個(gè)花籃，其發(fā)射團(tuán)就在中間。目前發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白包括綠、青、黃、紅色。綠色熒光蛋白是很有用的，一個(gè)可以做報(bào)告基因。大家都知道，我們可以用基因工程的方法，把一些基因插入到我們感興趣的生物中去，然后讓它表達(dá)。到底表不表達(dá)，一般很難知道，有了綠色熒光蛋白后，我們可以把綠色熒光基因和要表達(dá)的基因連在一起，要表達(dá)就兩個(gè)一起表達(dá)，綠色熒光蛋白很容易識(shí)別，一下就能看出，只要綠色熒光蛋白表達(dá)了，那么那個(gè)基因也表達(dá)了。這是美國(guó)密蘇里大學(xué)做的轉(zhuǎn)基因豬，最近通過(guò)克隆技術(shù)培育出四只含有熒光水母基因的小豬，證明轉(zhuǎn)基因豬是可以傳代的。利用熒光蛋白可進(jìn)行能量傳遞，如果兩個(gè)蛋白分別連上綠色和紅色熒光蛋白，一旦將兩分子結(jié)合，用藍(lán)光照射綠色熒光蛋白，結(jié)果看不到綠光，看到的是紅光，相當(dāng)于綠色熒光蛋白把能量吸過(guò)來(lái)，然后無(wú)輻射轉(zhuǎn)移給另外一個(gè)熒光蛋白，我們把這兩個(gè)蛋白稱為供體和受體。這種圖很形象，供體和受體之間距離越小，轉(zhuǎn)移效果越大，也就是說(shuō)轉(zhuǎn)移效率與兩體之間距離成反比，用此可測(cè)量生物大分子間的距離。比如說(shuō)人們感興趣的麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），利用這個(gè)方法就可以很清楚的測(cè)出這個(gè)麥芽糖結(jié)合部位到那個(gè)大分子間的距離。另外利用能量轉(zhuǎn)移的有無(wú)，也可以看出蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間是否有相互作用。利用熒光技術(shù)還可對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定位，2001年，我國(guó)實(shí)驗(yàn)性微生物學(xué)研究成果首次在美國(guó)《Science》上刊登，就是由我們所的張永連院士在小鼠的附睪當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了B1b這個(gè)基因，這個(gè)基因可以殺死細(xì)菌，我們用熒光技術(shù)準(zhǔn)確定位該基因在附睪中的定位。熒