實(shí)驗(yàn)三葉綠素含量的測(cè)定等課件

實(shí)驗(yàn)三、

葉綠體色素含量的測(cè)定（分光光度法和SPAD葉綠素儀法

）

高等植物在光合反應(yīng)中吸收光能的主要色素為葉綠素,其含有的葉綠素a和葉綠素b能將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,形成有機(jī)物質(zhì)。因此,葉片中葉綠素含量的高低是反映植物葉片光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)。一、目的:

了解分光光度計(jì)和SPAD葉綠素儀的使用方法；理解分光光度計(jì)測(cè)定葉綠體色素含量的實(shí)驗(yàn)原理；掌握計(jì)算葉綠體各色素成分含量的方法。

實(shí)驗(yàn)三、葉綠體色素含量的測(cè)定（分光光度法和SPAD葉綠1要求：2、問(wèn)答題：（1）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其數(shù)學(xué)表達(dá)式（并說(shuō)明各符號(hào)的代表意義）。Lambert-Beer定律中的比例系數(shù)“K”的物理意義是……？Lambert-Beer定律本身是否有局限性？何謂吸光度的加和性？

（2）葉綠素在蘭光區(qū)的吸收峰高于紅光區(qū)的吸收峰,為何不用蘭光區(qū)的光吸收來(lái)測(cè)定葉綠素的含量？（3）本實(shí)驗(yàn)為什么要用光路寬度為1cm的比色杯？要求：2二、原理

葉綠素提取液中同時(shí)含有葉綠素a和葉綠素b,二者的吸收光譜雖有不同,但又存在著明顯的重疊（如圖）,在不分離葉綠素a和葉綠素b的情況下同時(shí)測(cè)定葉綠素a和葉綠素b的濃度,可分別測(cè)定在665nm和649nm的光吸收,由于在該波長(zhǎng)時(shí)葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，我們即可以根據(jù)Lambert-Beer定律,列出濃度C與光密度D之間的關(guān)系式：

D665=83.31Ca+18.60Cb……….(1)D649=24.54Ca+44.24Cb……….(2)

從而計(jì)算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的濃度.葉綠素a、b的比吸收系數(shù)波長(zhǎng)(nm)葉綠素a葉綠素b66583.3118.6064924.5444.24注：(1)(2)式中的D665、D649為葉綠素溶液在波長(zhǎng)665nm和649nm時(shí)的光密度。葉綠素a、b的濃度單位為：g/L

二、原理葉綠素提取液中同時(shí)含有葉綠素a葉綠素a、b的比吸收3解方程式(1)(2)，則得：Ca=13.7D665—5.76D649

………(3)Cb=25.8D649—7.6D665………..(4)G總=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5)注：此時(shí)，Ca、Cb為葉綠素a、b濃度，單位為:mg/L，利用上面（3）（4）(5)式，即可以計(jì)算葉綠素a、b含量及總?cè)~綠素的總含量(G總)。

解方程式(1)(2)，則得：注：此時(shí)，Ca、Cb為葉綠素a、4

二、材料：

大紅花老葉和嫩葉

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取新鮮大紅花葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。2.稱取剪碎的新鮮樣品0.5g，放入研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂及2～3ml95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，暗處?kù)o置3～5min。3.取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。5.把葉綠體色素提取液稀釋5倍后倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95％乙醇為參比，在波長(zhǎng)665nm、649nm下測(cè)定光密度。

二、材料：

大紅花老葉和嫩葉

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.取5四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7D665—5.76D649………(3)Cb=25.8D649—7.6D665………..(4)G總=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649………(5)分別計(jì)算葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量Chl（mg/g.FW）=四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式子：6原理：

SPAD-502葉綠素儀通過(guò)測(cè)量葉片在兩種波長(zhǎng)光學(xué)濃度差方式650nm和940nm來(lái)確定葉片當(dāng)前葉綠素的相對(duì)數(shù)量。測(cè)量值是通過(guò)對(duì)在二個(gè)不同波長(zhǎng)區(qū)域，葉片傳輸光的數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，在這二個(gè)區(qū)域葉綠素對(duì)光吸收不相同的。這二個(gè)區(qū)域是紅光區(qū)(對(duì)光有較高的吸收且不受胡蘿卜素影響)和紅外線區(qū)(對(duì)光的吸收極低)開(kāi)機(jī)調(diào)零測(cè)量1測(cè)量2測(cè)量3求平均值原理：開(kāi)機(jī)調(diào)零測(cè)量1測(cè)量2測(cè)量3求平均值7一分光光度計(jì)的工作原理：

分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。一分光光度計(jì)的工作原理：8二分光光度計(jì)的基本常識(shí)：1、紫外光分光光度計(jì)，其使用波長(zhǎng)在190－400nm,可見(jiàn)光分光光度計(jì)，其使用波長(zhǎng)在400－800nm。2消光系數(shù)：是溶液對(duì)光吸收的比例常數(shù)，指在一定的濃度和波長(zhǎng)等條件下物質(zhì)的光吸收值，用K表示。它取決于溶質(zhì)性質(zhì)、入射光波長(zhǎng)和溫度。消光度（也叫光密度OD，或吸光值A(chǔ)）：表示溶液吸收光的強(qiáng)弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液對(duì)光吸收的程度愈大。透光率（用T表示）：是透射光強(qiáng)度（透過(guò)比色皿）與入射射光強(qiáng)度（還未過(guò)比色皿之前的光強(qiáng)度）之比（用T=It/I0表示）

。二分光光度計(jì)的基本常識(shí)：9三、分光光度計(jì)的基本維護(hù)及使用注意事項(xiàng)：1分光光度計(jì)必須放置在固定且不受震動(dòng)的儀器臺(tái)上，不能隨意搬動(dòng)。嚴(yán)防震動(dòng)、潮濕和強(qiáng)光直射。2分光光度計(jì)內(nèi)放有硅膠干燥袋應(yīng)定期更換。3儀器連續(xù)使用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2小時(shí)，每次使用需歇半小時(shí)以上才能再用。用完儀器后，務(wù)必關(guān)避電源開(kāi)關(guān)，拔下插頭。清理儀器上的雜物（包括灰塵、水嘖、溶液等）。4千萬(wàn)不可用手、濾紙、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。不允許用酒精、汽油、乙醚等有機(jī)溶液擦洗儀器。5盛待液時(shí)，必須達(dá)到比色杯的2/3左右，不宜過(guò)多。用完比色杯后應(yīng)立即用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水洗凈。6每套分光光度計(jì)上的比色杯及比色槽不得隨意更換。7測(cè)定某未知待測(cè)液時(shí)，先制作該溶液的吸收光譜曲線，再選擇最大峰的波長(zhǎng)作為測(cè)定的波長(zhǎng)。一般所制成的溶液應(yīng)盡量使光密值在0.1－0.7的范圍內(nèi)測(cè)定。三、分光光度計(jì)的基本維護(hù)及使用注意事項(xiàng)：10VIS-723N可見(jiàn)分光光度計(jì)

比色皿校正和多波長(zhǎng)測(cè)定操作步驟：1.在主菜單下選擇“2光度測(cè)量”主菜單1波長(zhǎng)掃描2光度測(cè)量3定量分析4時(shí)間掃描5實(shí)時(shí)測(cè)量6系統(tǒng)設(shè)置

3.比色皿配對(duì)完成后，按“RETURN”鍵退回光度測(cè)量參數(shù)設(shè)置界面。4.按F2開(kāi)始測(cè)量?？砂凑掌聊簧系奶崾具M(jìn)行測(cè)量操作，當(dāng)有多個(gè)樣品需要測(cè)量時(shí)，可測(cè)完一個(gè)后再按“F2”測(cè)下一個(gè)。注意樣品的編號(hào)N值必須和比色皿的編號(hào)一致。2.按“F1”進(jìn)行比色皿的校正，輸入除參比杯外的比色杯個(gè)數(shù)后按“ENTER”鍵，再按“F2”，根據(jù)儀器提示進(jìn)行操作即可。VIS-723N可見(jiàn)分光光度計(jì)

比色皿校正和多波長(zhǎng)測(cè)定11AM-300手持式葉面積儀測(cè)定葉面積原理：內(nèi)置固體標(biāo)準(zhǔn)光源的CCD掃描系統(tǒng)開(kāi)機(jī),按住電源開(kāi)關(guān)1秒

選擇顯示方向

放入材料（不能直接接觸探頭）

按住探頭上紅色button,直至發(fā)出兩種連續(xù)蜂鳴,屏幕提示“measure”可開(kāi)始測(cè)量探頭從材料上方勻速滑過(guò)，等屏幕顯示出完整葉片形狀后再次按紅色button結(jié)束測(cè)量AM-300手持式葉面積儀測(cè)定葉面積原理：內(nèi)置固體標(biāo)準(zhǔn)光源的12植物葉面積的測(cè)定（畫(huà)紙稱重法）

將所測(cè)葉片放在厚度均勻的稱量紙上，用鉛筆將葉形畫(huà)好，剪下所畫(huà)的紙葉，在電子天平上稱重，記為W1；另取10*10cm2的紙片，稱重記為W2；則所測(cè)葉片面積X可按下面公式計(jì)算出。X（cm2）＝W1/W2×100植物葉面積的測(cè)定（畫(huà)紙稱重法）13CB-1102便攜式光合蒸騰測(cè)定儀CB-1102便攜式光合蒸騰測(cè)定儀14特點(diǎn)：非破壞性測(cè)量，即不離體測(cè)量具有開(kāi)路和閉路測(cè)量?jī)煞N光合測(cè)量方式可以手動(dòng)或自動(dòng)測(cè)量，可編程自動(dòng)定時(shí)測(cè)量全部測(cè)量參數(shù)和計(jì)算結(jié)果可以存貯，并通過(guò)RS232接口傳輸?shù)接?jì)算機(jī)特點(diǎn)：非破壞性測(cè)量，即不離體測(cè)量15原理：利用紅外CO2分析器和濕度傳感器對(duì)參考?xì)夂土鹘?jīng)葉室后的測(cè)量氣進(jìn)行測(cè)量，根據(jù)CO2濃度差和濕度差以及流量等參數(shù)，利用氣體通量公式，分別計(jì)算凈光合（或呼吸）速率和蒸騰速率。原理：利用紅外CO2分析器和濕度傳感器對(duì)參考?xì)夂土鹘?jīng)葉