自生固氮菌的分離鑒定

自生固氮菌的分離鑒定楊從發(fā)1,王淑軍1,陳靜1,許興友2(1.淮海工學院食品工程系，江蘇連云港，222005)

(2.淮海工學院化學工程系，江蘇連云港，222005)淮海工學院學報，1999，8(2)摘要：從非豆科作物根際土壤中分離篩選得到213個在無氮培養(yǎng)基上能良好生長的菌株，通過酶活測定，從中篩選得到18株固氮能力較強的菌株，并對其中酶活最高的4株菌株進行了鑒定，結果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。利用它們可望制成適合于不同農作物生長的生物復合肥。關鍵詞：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料0引言微生物肥料的一些作用和生態(tài)效益是化學肥料所不具備的［1］，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生長和抑制有害微生物的活動，從而達到增產的目的⑵。此外，生產微生物肥料投資少，可利用農副產品就地取材。因而，微生物肥料的生產吸引了許多研究者的興趣。本文報道從水稻、小麥、玉米和蔬菜等非豆科作物根際土壤中分離得到18株固氮能力較高的自生固氮菌，并對其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株進行了分類鑒定，結果表明它們屬于固氮菌科的不同屬。1材料和方法1.1菌種采集水稻、小麥、玉米和蔬菜等農作物的根際土壤土樣56個，從中分離獲得213株在無氮培養(yǎng)基上能良好生長的菌株。1.2分離培養(yǎng)基及分離方法1.2.1富集培養(yǎng)基蔗糖15g，磷酸二氫鉀0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉0.2g，碳酸鈣1g，質量分數為10%的鉬酸鈉、硼酸、硫酸錳、硫酸亞鐵(現(xiàn)配)水溶液各1mL，水1000mL，pH為6.5?7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分裝30mL，滅菌備用。1.2.2富集培養(yǎng)方法取3?5g土樣用50mL水制成混濁液，吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL富集培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，100rpm，28^，培養(yǎng)3?5天后，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復4?5次后，稀釋分離。1.2.3平板分離培養(yǎng)基在富集培養(yǎng)基中加入2%瓊脂制成平板分離培養(yǎng)基，滅菌后，倒入無菌培養(yǎng)皿中備用。1.2.4分離方法取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，稀釋涂布平板分離培養(yǎng)基°28°C培養(yǎng)2天后，將在稀釋度較大的平板上，生長較大的菌落移入斜面。培養(yǎng)后，保藏備用。1.3固氮酶活性測定1.3.1氣相色譜法參考文獻［3］的方法，略加改變，將2mL乙炔氣體沖入試管斜面內，塞上無菌橡皮塞，28C，培養(yǎng)24h后，用氣相色譜儀測量固氮酶的活性，每種取4?5個重復，進樣量100ML，按以下公式進行計算酶活。EA7=(58.0XSeXTXPe)/(SbXTeXPXt)(以mol/h(斜面))Se：乙烯峰面積;T：開氏絕對溫度(T=273.13K)Pe:實驗條件下的大氣壓強(Pa);Sb：乙炔峰面積;Te：實驗條件下的溫度(K);P：絕對大氣壓強(P=101324.72Pa);t=培養(yǎng)時間(t=24h)

1.3.2微量凱氏定氮法囹 用以下公式計算含氮量:EA2=((V1-V2)X14X1000)/V(mg/L)V1：樣品滴定時用去的0.01N標準硫酸溶液毫升數；V2：空白滴定時用去的0.01N標準硫酸溶液毫升數；14：是1個毫克當量氮的毫克數；V：發(fā)酵液樣品毫升數。2結果和討論2.1分離結果從非豆科作物根際土壤中分離得到213個菌株，用氣相色譜法和微量凱氏定氮法測定它們的固氮酶活性。結果發(fā)現(xiàn)，34株沒有固氮能力(含氮量＜1mg/L),161株有固氮能力(含氮量1?10mg/mL),18株固氮能力較強(含氮量＞10mg/mL),其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌產酶能力最高。表1對固氮能力較強的18株菌株的酶活測定結果進行了統(tǒng)計。表1：固氮酶活力測定結果(18株菌株)HQEHQEA2榮株母r.ti「心pmal-'h|/i.pmal-'h|/i.11..1Ml1.1.D14.Ah?i7；板n46.1Hl*1LIn.4.H.n笠..im112.2/i.pmcil/h|Zim155.5任.6121.27Ti斗r ■.14.n30.51DI.2牌.H771647..1.12.7p心撲.4.ID.6表1中,，EAl(“mol/h表1中,，EAl(“mol/h斜面)是用氣相色譜法)EA1=(58.0XSsXTxPe)/(SbXiTeXPXt)U?底U定各菌株的試管斜面的固氮酶活性值。按以下公式計算:rH4ri45.4Iri.2雖然理論上，在固定條件下，乙快還原活性與固氮酶對氮氣的固定活性呈正相關，但在實際實驗過程中，會由于斜面的新鮮程度，斜面培養(yǎng)基中的杲些組成等原因，而影響實驗結果的準確性，所以，每種菌都取5支對數生長期的斜面做重復試驗，以盡量減少誤差。EA2(mg/L)是將菌株接種到無氮培養(yǎng)液中，28°C，100rpm培養(yǎng)7天后，用微量凱氏定氮法測定最終發(fā)酵液的含氮量。按以下公式計算：EA2=((V1-V2)X14X1000)/V(mg/L)經回歸分析［6］，EA1與EA2呈強正直線相關(相關系數r=0.9527)，回歸方程為EA2=7.9560+0.5016XEA1，其結果與文獻［3］的有關報道相似。2.2鑒定結果2.2.1形態(tài)特征 見表2所示。表2形態(tài)特征垠.咨

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