免疫學檢測原理防治

1免疫學檢測原理和免疫學防治王平章2015年6月12日2教學要求掌握抗原抗體反應的特點掌握ELISA的基本原理熟悉檢測體液免疫和細胞免疫的常用方法了解免疫學檢測方法的應用熟悉疫苗的種類及發(fā)展方向了解免疫學防治的措施3第二十二章免疫學檢測技術4免疫學檢測技術習慣上，將利用未做修飾的抗原、抗體以及補體進行的相關檢測方法，稱為經典免疫學技術，如凝集反應、沉淀反應等血清學檢測技術將利用各種標記的抗原或抗體、以及利用輔助工具如流式細胞術開展的檢測技術,免疫細胞技術等，習慣上歸屬為現代免疫學技術5免疫學檢測技術抗原抗體反應的原理,特點及影響因素常見的檢測抗原或抗體的體外試驗免疫細胞功能檢測6第一節(jié)體外抗原抗體反應（血清學反應）7

抗原抗體反應的原理抗原的抗原決定基與抗體的結合部位之間的結構具有互補性，二者相互結合后，在適宜的條件下，可出現可見反應。

Ag2

Ag1Ab8抗原抗體反應的特點高度特異性可逆性依賴一定的抗原、抗體濃度及比例抗原抗體反應呈現的兩個階段91、高度特異性指一種抗原只能與由它刺激所產生的抗體結合的專一性。特異性由抗原表位與抗體的CDR(complementarity-determiningregion)互補結合所決定。

Ab10人血清中的抗體是具有多樣性思考：Ig多樣性的分子機制？11抗體的特異性是免疫學檢測技術的基礎各種檢測Westernblotting

ImmunofluorescenceELISAELISPOTProteinmicroarray診斷,預防,治療122、抗原抗體反應的可逆性抗原抗體的結合主要是分子表面的非共價結合，穩(wěn)定，但在適當條件下可以解離，各自生物學特點不變。13抗體純化、免疫親和層析AgarosebeadsAgarosebeads14免疫(共)沉淀AgarosebeadsAg/Bait免疫沉淀-Immunoprecipitation(IP)免疫共沉淀-Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Prey目的抗原蛋白質復合物15magneticparticles/beadsCD19Bcell磁珠分選細胞16AbexcessAgexcess3、適宜的抗原抗體濃度和比例Equivalence–Latticeformation抗原、抗體在一定濃度和比例時可出現肉眼可見的反應物（凝集物或沉淀物）；比例合適、顆粒性抗原，或IgM易形成大分子IC。實踐中，需要調整兩者的比例，如倍比稀釋的方式，避免假陰性。思考：中等大小IC的病理意義？174、抗原抗體反應的兩個階段特異性結合階段迅速，數秒至數分鐘內完成，一般無肉眼可見的反應(肉眼)可見反應階段IC之間靠電荷作用聚集，數分鐘-數天不等。思考：現代免疫檢測技術的優(yōu)勢？18請勿超過MAX線MAX線陽性無效陰性膠體金免疫層析法（膠體金標記技術+免疫層析）19Anti-HCG(Ab1)膠體金標記CTHCGAnti-HCG(Ab2)Anti-Ab1(Ab3)20抗原抗體反應的影響因素1、電解質2、溫度:37℃3、酸堿度:pH6-8之間21第二節(jié)檢測抗原和抗體的體外試驗22檢測抗原或抗體的方法傳統(tǒng)血清學反應直接凝集反應間接凝集反應單向瓊脂擴散雙向瓊脂擴散免疫標記技術免疫酶測定法免疫熒光技術放射免疫測定法免疫印跡技術，等經典免疫學技術現代免疫學技術23凝集反應(agglutinationreaction)24直接凝集反應++++++++++-ABO血型鑒定菌種鑒定、血清型鑒定25葡萄球菌乳膠凝集試劑盒D群鏈球菌乳膠凝集試劑盒大腸桿菌O157乳膠凝集試劑盒鏈球菌乳膠凝集試劑盒李斯特氏菌乳膠凝集試劑盒艱難梭狀芽孢桿菌乳膠凝集試劑盒彎曲桿菌乳膠凝集試劑盒金黃色葡萄球菌乳膠凝集試劑盒間接凝集反應(反向)聚苯乙烯乳膠顆粒26可溶性抗原，液體或半固體瓊脂凝膠中進行在液體中形成沉淀環(huán)和絮狀沉淀凝膠中沉淀反應單向瓊脂擴散雙向瓊脂擴散免疫電泳沉淀反應(precipitationreaction)27免疫標記技術

(immunolabelingtechnique)用放射性核素、酶、熒光素等示蹤劑標記抗原或抗體后進行抗原抗體反應靈敏度高、快速；可用于定性、定量、定位分析等。改變的是抗原抗體反應的可見方式，并不改變反應的本質及特點28免疫酶測定法

(enzymeimmunoassay,EIA)抗原抗體反應的高度特異性+酶對底物的高效催化作用酶聯免疫吸附試驗EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay,ELISA29酶聯免疫吸附試驗將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應在固相表面進行，常用于測定可溶性抗原或抗體，如檢測血清、胸水、腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清等。酶標記抗原或抗體1酶分解底物產生有色物質2酶標儀對有色物質進行測定3通過光密度值（OD）評價抗體或抗原含量430

DirectELISA

IndirectELISASandwichELISA

CompetitiveELISA待檢抗體待檢抗原已知抗原已知抗體31思考：幾個抗原抗體反應？32BAS-ELISA：生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)ELISA的放大系統(tǒng)33免疫組化技術

(immunohistochemistrytechnique)利用標記的特異性抗體在組織/細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對抗原進行定位、定性和定量檢測的技術?？稍诩毎?、亞細胞水平檢測各種抗原物質。

標記物：酶（如HRP,AP）、熒光素、膠體金等組織標本：石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片細胞標本：細胞爬片，細胞涂片，組織印片。34×200×200×400×400食管鱗狀細胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma)結腸腺癌(colonadenocarcinoma)35胃底腺黏膜36放射免疫測定

(radioimmunoassay,RIA)利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應的方法敏感度pg水平,常用于檢測微量物質胰島素,生長激素,甲狀腺素,嗎啡,地高辛藥物和IgE等.美國科學家耶洛(RosalynYalow)采用131I標記的胰島素作為失蹤劑，利用胰島素與其特異性抗體之間的反應，建立了胰島素的放射免疫測定法，而獲得1977年諾貝爾生理或醫(yī)學獎。37免疫熒光技術

(immunofluorescencetechnique)某些物質在特定波長范圍內的光照下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。這些受激發(fā)后能產生熒光的物質稱為熒光素?？蓸擞浛乖蚩贵w。38異硫氰酸熒光素藻紅蛋白39可以用于檢查細菌、病毒、螺旋體等抗原、抗體，幫助診斷傳染??；也可以鑒定細胞表面的CD分子，檢測AID的抗核抗體等。4041免疫印跡技術(immunoblotting,Westernblotting)將十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分離得到的按分子量排列的蛋白質轉移到固相載體膜上，再利用標記（如酶、放射性核素、熒光素）的特異性抗體對蛋白質進行定性和定量分析的技術。廣泛應用于生物、醫(yī)學各領域。4243體內示蹤44第三節(jié)免疫細胞功能的檢測45T細胞功能B細胞功能CTL、NK細胞功能吞噬細胞功能免疫細胞的分離細胞因子測定46免疫細胞的分離外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)PBMC=lymphocyte+monocyte+DC47密度梯度離心-isolationofPBMC1.077g/ml離心后各細胞沉降于密度梯度液中與自身密度相同的密度平衡點1.075g/ml48免疫吸附法：抗體包被于聚苯乙烯培養(yǎng)板,加入淋巴細胞懸液，表達相應細胞表面標志的淋巴細胞被貼附在培養(yǎng)板上，從而與其他細胞分開。免疫磁珠法(immunemagneticbead,IMB)：抗體與磁珠交聯;magnetic-activatedcellsorting,MACS.熒光激活細胞分離儀分離法/流式細胞術分離法（fluorescenceactivatedcellsorting,FACS）（flowcytometry,FCM）抗原特異性的CTL：抗原肽－MHC分子四聚體技術

淋巴細胞及其亞群的分離49免疫磁珠分離法antibodycoatedmagneticbeadsantigenpositivecellscellsuspensionantigennegativecellsdissociatingagentantigenpositivecellsseparatecellsinamagneticfield50流式細胞術(FACS/FCM)細胞被熒光標記

(Ab，熒光蛋白）單細胞排列被快速噴出細胞受激發(fā)產生散射光判定細胞是否需要分選細胞被賦予不同的電荷可同時測定多項參數可多色熒光組合使用(被熒光標記的單細胞懸液）5152流式細胞術操作流程樣本收集及處理制備單細胞懸液免疫熒光染色上機檢測數據分析53流式細胞術的應用細胞大小細胞顆粒度DNA含量RNA含量蛋白質含量細胞表面積核漿比例

……特異性抗原、受體細胞內的細胞因子蛋白質的修飾增殖/凋亡/存活狀態(tài)pH值鈣離子濃度細胞膜電位、線粒體膜電位

……細胞結構細胞功能54SpleenThymus55抗原肽-MHC分子四聚體技術四聚體技術即MHC-I類分子-肽四聚體復合物標記CTL的流式細胞檢測技術56免疫細胞功能測定T細胞功能測定B細胞功能測定CTL,NK細胞功能測定吞噬細胞功能測定57T細胞增殖試驗形態(tài)計數法

增殖時體積增大，形態(tài)不規(guī)則，胞質增多，核松散，較多核仁3H標記的胸腺嘧啶（3H-TdR）摻入法/125I-UdR摻入法MTT法58MTT法3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽甲瓚淡黃色，可溶性藍紫色，不溶性59遲發(fā)型超敏反應的檢測

(delayed-typehypersensitivity,DTH)體內檢測，細胞免疫功能皮試常用的生物性抗原：結核菌素、念珠菌素、麻風菌素、鏈激酶-鏈道酶和腮腺炎病毒等。原理:

遲發(fā)型超敏反應/Ⅳ型超敏反應，產生以單個核細胞浸潤和局部組織細胞損傷為主的炎癥。陽性反應表現為局部紅腫和硬結，反應強烈的可發(fā)生水腫，甚至壞死。60結核菌素試驗

(包括OT-test和PPD-test兩種試驗)OT試驗：舊結核菌素（結核桿菌培養(yǎng)液濃縮后的粗制品）PPD試驗：純蛋白衍化物（結核桿菌培養(yǎng)物的純化制品）皮試48～72小時有紅腫硬結>5毫米為陽性，否則為陰性正常人為弱陽性，即硬結直徑為5～9mm20mm以上或局部皮膚發(fā)生水泡與壞死者為強陽性反應，提示可能有活動性感染61B細胞功能測定單向瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中IgG、IgA、IgM等各類Ig的含量。抗體形成細胞測定：常用溶血空斑試驗檢測（plaqueformingcelltest,PFCtest）脾臟細胞懸液+綿羊紅細胞(SRBC)+補體62細胞毒試驗（殺傷細胞活性檢測）檢測CTL、NK等細胞殺傷靶細胞活性的技術，主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應和病毒感染等方面的研究CTL介導的細胞毒試驗：常采用51Cr釋放法NK細胞的細胞毒試驗：常用的靶細胞為K56263殺傷試驗：Cr釋放法64凋亡細胞檢測法形態(tài)學檢測FACS(FITC-AnnexinV選擇性結合磷酯酰絲氨酸)梯狀凝膠電泳TUNEL法（DNA斷裂缺口中的3’-OH的原位標記）凋亡信號通路的活化狀態(tài)Westernblot檢測靶分子切割…晚期早期HeLaDNA電泳PS外翻65吞噬功能測定將吞噬細胞與某種可被吞噬又易于計數的顆粒性物質混合溫育后，顆粒物質被吞噬細胞吞噬，根據吞噬百分率即可反映吞噬細胞的吞噬能力。巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗硝基藍四氮唑（NBT）還原試驗酵母聚糖(zymosan)吞噬試驗zymosanphagocytosisbyhumanneutrophils66細胞因子的檢測（1）生物活性檢測法根據不同的細胞因子具有的不同的生物學活性，可采取相應的測定方法。①細胞增殖或抑制法：CTLL-2依賴IL-2；IL-1對黑色素瘤細胞A352具有抑制作用②細胞病變抑制法：干擾素抑制病毒感染細胞67（2）免疫學檢測法①幾乎所有的細胞因子都可以用ELISA（如雙抗體夾心法）進行檢測。②胞內細胞因子檢測法（通常要用蛋白轉運抑制劑處理，如BFA）③酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linkedimmunospot,ELISPOT）產生細胞因子或抗原特異性的抗體分泌細胞的細胞頻數檢測68ELISPOT69計算斑點70第二十三章免疫學防治71疫苗的使用與疾病控制其他傳染?。菏笠?、霍亂、梅毒、瘧疾、狂犬病、肺結核…72許多疾病無有效疫苗病毒：HIV，皰疹病毒細菌：葡萄球菌，A組鏈球菌真菌：假絲酵母原生動物：瘧疾，利什曼病蠕蟲感染：血吸蟲病…皮膚暗絲孢霉菌(phaeohyphomycosis)73疫苗開發(fā)策略的轉變反向/逆向疫苗策略

(reversevaccinology)74滅活疫苗（死疫苗）減毒活疫苗類毒素疫苗亞單位疫苗結合疫苗聯合疫苗重組載體疫苗DNA疫苗合成肽疫苗食用疫苗…現代疫苗種類