培養(yǎng)肉的研究進展與挑戰(zhàn)

培養(yǎng)肉的研究進展與挑戰(zhàn)

周光宏丁世杰徐幸蓮（南京農業(yè)大學食品科技學院國家肉品質量安全控制工程技術研究中心教育部肉品加工與質量控制重點實驗室農業(yè)農村部肉品加工重點實驗室江蘇省肉類生產與加工質量控制協同創(chuàng)新中心南京210095）肉類因含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分而成為人類最重要的食品之一。隨著世界總人口的增長以及發(fā)展中國家生活水平的提高，全球肉類消費量持續(xù)升高，預計到2050年會增加50%以上[1]。2030年，我國的人均肉類消費量預計較2010年增長100%～200%[2]。依賴畜牧業(yè)的肉類生產方式與資源環(huán)境稟賦之間的矛盾日益突出，畜牧業(yè)生產資源消耗多，溫室氣體排放量大，對環(huán)境污染嚴重，同時也存在動物福利和健康等方面的問題[1]。近年來，非洲豬瘟、禽流感等動物疫病的流行也給肉類安全生產帶來嚴峻的挑戰(zhàn)，亟需開發(fā)高效綠色的肉類生產技術。培養(yǎng)肉技術是近年來興起的一項顛覆性肉類生產技術，可以部分取代傳統畜牧業(yè)生產肉類，是一種未來食品生產技術[3-4]。培養(yǎng)肉（CulturedMeat，亦稱為細胞培養(yǎng)肉或培育肉）是依據動物肌肉生長修復機理，利用其干細胞進行體外培養(yǎng)而獲得的肉類，它不需要經過動物養(yǎng)殖，直接用細胞工廠化生產肉類[5-7]。培養(yǎng)肉技術是近年來興起的一項具有顛覆性的未來食品生產技術，與傳統肉類生產方式相比，培養(yǎng)肉可以減少7%～45%的能源消耗，降低78%～96%的溫室氣體排放量，降低99%的土地使用，減少82%～96%的用水量等[8]。2013年8月，荷蘭MarkPost教授在英國倫敦舉辦了全球首次培養(yǎng)牛肉漢堡試吃大會，第1次證明了培養(yǎng)肉的概念的可行性[9]。自2013年以來，對培養(yǎng)肉的研究在國際上迅速發(fā)展，取得了一系列重大突破。2019年11月18日，南京農業(yè)大學使用豬肌肉干細胞培養(yǎng)20d，獲得中國第1塊細胞培養(yǎng)肉。由于基礎研究、工業(yè)化生產、食品化技術以及安全監(jiān)管等問題，目前全球還沒有培養(yǎng)肉商業(yè)化產品。本文首先總結了培養(yǎng)肉的發(fā)展歷程，然后從肌肉的生長發(fā)育規(guī)律出發(fā)，結合肉類的理化性質和加工特性，從種子細胞獲取、干性維持、無血清培養(yǎng)條件、擴大培養(yǎng)、大規(guī)模分化、食品化技術、產品安全評價與管理規(guī)范7個方面闡述培養(yǎng)肉產業(yè)化生產的挑戰(zhàn)及可能的未來發(fā)展方向，為培養(yǎng)肉相關領域的技術發(fā)展提供參考。1培養(yǎng)肉發(fā)展歷程培養(yǎng)肉的概念早在1931年由丘吉爾提出[10]，經過近80年的技術積累才逐漸變?yōu)楝F實。動物肌肉的生長發(fā)育、細胞生物學和組織工程等科學技術的發(fā)展推動了培養(yǎng)肉技術研究。表1梳理了培養(yǎng)肉的發(fā)展歷史。表1培養(yǎng)肉的發(fā)展歷史Table1Eventsinculturedmeathistory2肌肉發(fā)育及損傷修復培養(yǎng)肉的生產是模擬和遵循動物肌肉的生長發(fā)育以及肌肉損傷修復規(guī)律。深入研究肌肉組織發(fā)育和損傷修復過程，可以為培養(yǎng)肉生產提供理論和技術支撐。肌肉細胞的發(fā)育主要分為胚胎期、胎兒期以及出生后3個部分[20-21]。在發(fā)育過程中，一部分細胞分化形成軸旁中胚層，再發(fā)育為生皮肌節(jié)，最后進一步發(fā)育成為肌肉祖細胞。肌肉祖細胞相互融合形成初級肌纖維和次級肌纖維，幫助胚胎期和胎兒期的肌肉形成。出生以后，肌肉則主要依靠增加肌原纖維骨架蛋白合成實現肌肉增長[20-21]。在成體肌肉組織中，還存在肌肉干細胞（MuscleStemCell，MuSC）。肌肉干細胞又被稱為肌衛(wèi)星細胞（Satellitecell），主要來源于胎兒期的肌肉祖細胞，負責出生后的肌肉組織損傷修復[22]。在肌肉發(fā)育和損傷修復過程中，肌源性細胞會表達特異性的轉錄因子，包括Pax3/7以及其它的肌肉調節(jié)因子，如Myf5，MyoD，Mrf4和Myog等，并最終表達肌肉細胞特有的如MyHC等肌肉蛋白[20]。肌肉細胞形成的主要生物學過程見圖1。闡明肌細胞形成規(guī)律，為體外形成肌肉組織奠定了良好的理論基礎，推動了培養(yǎng)肉的研究進程。3肉的組成及加工特性肉類的肌肉蛋白質賦予肉獨特的理化性質和加工特性。從化學成分上來說，肉中的蛋白質含量約為20%，是最重要的營養(yǎng)成分[23-24]。肉中的蛋白質主要包括約50%的肌原纖維蛋白，約30%的肌漿蛋白和約20%的基質蛋白[24]。肉中的蛋白質對于肉的加工特性、質構、風味、顏色等都有著非常重要的作用[24-25]。肌原纖維蛋白是肉制品加工過程中最重要的蛋白質，在較高的鹽離子強度下，肌原纖維蛋白充分溶解，幫助形成良好的肌肉蛋白凝膠制品。肌漿蛋白可以增強肌原纖維蛋白凝膠。結締組織蛋白由于溶解性較差，因此對于肉制品的凝膠作用有限[24]。同時，肌肉蛋白對乳化型肉制品的乳化特性也非常重要。將肌漿蛋白和高鹽離子強度下溶解的肌原纖維蛋白一起作為乳化劑，可以降低脂肪和水之間的界面張力，形成穩(wěn)定乳濁液，肌原纖維蛋白的乳化特性更好[24]。另外，肌肉蛋白對于色澤（肌紅蛋白）、風味（美拉德反應）等食用特性也有非常重要的作用[26]。細胞培養(yǎng)肉目前還很難形成大塊的肌肉組織，而分化的肌管中富含大量的肌肉特有的蛋白質。考慮到肌肉組織中蛋白質的重要作用，在培養(yǎng)肉的生產過程中，應注重肌管生成效率，最大程度地生產肌肉細胞和肌肉細胞蛋白，從而幫助生產“真正”的培養(yǎng)肉肉制品。圖1骨骼肌細胞譜系圖Fig.1Proposedlineageschemeforskeletalmuscle4培養(yǎng)肉生產流程根據肌肉細胞的生物學過程以及肌肉的理化、加工特性，培養(yǎng)肉生產的第1要務就是生成大量的肌肉細胞及蛋白質。培養(yǎng)肉的產業(yè)化方案見圖2。首先需要分離獲取肌肉干細胞（muscleStemcell，MuSC）、胚胎干細胞（embryonicstemcell，ESC）或誘導性多能干細胞（inducedpluripotentstemcell，iPSC）、間充質干細胞（mesenchymalstemcell，MSC）和其它底盤細胞（Others）等種子細胞，種子細胞需要具有或可誘導的肌源性（脂源性）細胞命運；然后，通過生物反應器擴大培養(yǎng)，實現種子細胞的大規(guī)模增殖；再利用分化模具、生物反應器或3D打印的方法大規(guī)模生產肌肉組織；最后利用食品化加工技術制作培養(yǎng)肉產品。圖2培養(yǎng)肉產業(yè)化方案Fig.2Schematicofculturedmeatproduction5培養(yǎng)肉的研究進展及技術挑戰(zhàn)利用現有的技術方法，可以實現培養(yǎng)肉的小規(guī)模實驗室生產，然而，要實現培養(yǎng)肉低成本、高效率和產業(yè)化生產仍有很多技術難題需要攻克。5.1干細胞獲取干細胞獲取是培養(yǎng)肉生產的基礎。根據肌肉發(fā)育和損傷修復的生物學過程，肌源性細胞命運是培養(yǎng)肉種子細胞的必然要求。除此之外，培養(yǎng)肉的種子細胞還需具備以下的要求：①細胞要易于獲取，且能夠在體外持續(xù)增殖并有較高的肌管分化效率；②在培養(yǎng)過程中，細胞的基因組要相對穩(wěn)定。目前，適宜的培養(yǎng)肉種子細胞大致有以下幾種，包括肌肉干細胞、胚胎干細胞或誘導性多能干細胞、間充質干細胞和其它底盤細胞。肌肉干細胞又稱肌衛(wèi)星細胞，是肌肉組織中的專能干細胞。肌肉干細胞易于分離培養(yǎng)和肌源性分化特性使其成為良好的培養(yǎng)肉種子細胞[27]。由于肌肉組織中存在著至少十幾種不同類型的細胞，包括成纖維細胞、內皮細胞、血液細胞等，所以如何分離獲取畜禽動物高純度肌肉干細胞成為一大難題[28-29]。早期研究肌肉干細胞通常采用貼壁法或Percoll密度梯度離心法。這類的方法可以實現一定程度上的肌肉干細胞富集，然而方法的重復性和細胞純度存在較大的不穩(wěn)定性[28，30-31]。現階段的流式細胞分選技術則是根據肌肉干細胞特有的表面標志物進行分離，細胞純度很高，然而該方法的成本較高[28-29]。未來肌肉干細胞的分離技術需要通過肌肉干細胞特有的代謝特點，制定特異性的分離條件，選擇性地促進肌肉干細胞生長或者通過代謝障礙選擇性地抑制其它類型的細胞生長。相關的技術已應用于肌肉干細胞、心肌細胞的純化，然而穩(wěn)定性和細胞純度還需進一步研究[32-33]。其它細胞類型，由于自身不具有肌源性細胞命運，所以需要進行誘導才能作為種子細胞。胚胎干細胞和誘導性多能干細胞具有全能性，經過細胞命運調控，可以定向誘導分化為PAX7陽性的肌肉干細胞或者MyHC陽性的多核肌管[20，34]。相關的命運調控過程遵循胚胎肌肉發(fā)育過程。相關的研究也集中在小鼠和人的研究中，涉及畜禽動物的研究還較少[35]。未來研究ESC和iPSC作為培養(yǎng)肉種子細胞，需要建立相關的畜禽動物ESC/iPSC細胞系并完善培養(yǎng)方法，制定屬于畜禽動物最合適的肌源性誘導分化方法。間充質干細胞是一類多能性干細胞，具有分化成脂肪組織、骨組織和軟骨組織的潛力。已有的一些研究發(fā)現，間充質干細胞可以誘導分化形成肌細胞，然而分化效率很低[36-38]。未來將MSC作為種子細胞，需要進一步研究畜禽動物間充質干細胞的分離和培養(yǎng)方法，進行肌源性定向誘導分化研究，提高分化效率。另外，MSC可以作為脂肪組織的種子細胞，用來開發(fā)含有脂肪細胞的培養(yǎng)肉組織。除了上述的干細胞，通過異位基因表達，可以讓其它底盤細胞轉分化為成肌細胞，作為種子細胞。底盤細胞可以選取常見的成纖維細胞等，細胞來源較為容易。該方法需要通過基因編輯操作，使底盤細胞表達成肌決定因子，如MYOD，PAX3/7等，從而具有肌源性的細胞命運[20]。利用這類方法制作種子細胞，需要首先注意基因編輯操作直接用于食品的安全性評價。另外，需要構建畜禽動物異位表達成肌決定因子細胞株[39]。在培養(yǎng)肉的生產過程中，其它類型的種子細胞都需要誘導分化形成肌肉干細胞或者成肌細胞，通過肌源性細胞命運生產肌肉細胞和肌肉蛋白。在以下論述時，主要以肌肉干細胞作為討論對象。5.2肌肉干細胞的干性維持培養(yǎng)肉是需要在體外大量培養(yǎng)具有分化為肌管能力的種子細胞。以肌肉干細胞為例，肌肉干細胞的干性維持主要是維持細胞的增殖能力和肌源性分化能力。細胞在長期培養(yǎng)過程中會出現細胞增殖能力減弱，稱為海佛里克極限（HayflickLimit）[40]。其主要原因是端粒的長度在細胞分裂過程中逐漸縮短，最終引發(fā)基因組不穩(wěn)定而導致細胞衰老[40]。不僅如此，體外培養(yǎng)還會造成表觀遺傳變異、蛋白質穩(wěn)態(tài)失衡等一系列細胞衰老現象[41]。豬、牛等動物肌肉干細胞的體外培養(yǎng)結果表明：培養(yǎng)過程會導致細胞的增殖能力減弱，干性基因表達量下降，細胞的肌管形成能力和修復肌肉損傷的能力也顯著降低[28-29]。目前有研究發(fā)現，通過添加一定的炎癥因子來模仿骨骼肌再生的炎癥環(huán)境，能夠幫助肌肉干細胞增殖和干性維持[42-43]。另外，抑制p38信號通路也可以維持體外培養(yǎng)的肌肉干細胞干性[29，44]。目前的研究大多集中在小鼠模型上，未來能否借鑒應用于畜禽農產動物，還需做大量的研究。另外，能否通過基因編輯維持端粒酶活性，從而維持端粒的長度，延緩畜禽動物肌肉干細胞衰老，也需進一步研究。5.3無血清培養(yǎng)基胎牛血清是體外培養(yǎng)基中常見的補充物，然而胎牛血清來源困難，營養(yǎng)成分未知，批次之間品質難以控制，有感染病毒風險等問題[45]。建立無血清培養(yǎng)方法對于降低培養(yǎng)肉的生產成本，保證生產過程的可控性非常重要。J.vanderValk等[45]總結了開發(fā)無血清培養(yǎng)基的模塊化方法。在該金字塔模型中，由下到上包括基礎培養(yǎng)基、細胞外基質包被的培養(yǎng)表面、生長因子、激素、β-巰基乙醇、脂類、維生素等。越接近金字塔頂部，作為無血清培養(yǎng)成分的特異性越高[45]。目前針對胚胎干細胞、血液干細胞已開發(fā)出無血清培養(yǎng)基[46-47]。早期針對肌肉干細胞或成肌細胞的無血清培養(yǎng)發(fā)現，適宜的睪酮激素能夠幫助成肌細胞增殖[48]。類胰島素生長因子也能夠持續(xù)促進成肌細胞增殖[49-50]。Florini等[51]進一步測試了各類激素、糖蛋白和生長因子，最終總結出一種成肌細胞無血清培養(yǎng)條件。該培養(yǎng)基用Ham’sF-12作為基礎培養(yǎng)基，添加胎球蛋白、胰島素和地塞米松，最終得到的培養(yǎng)基能夠達到與10%馬血清培養(yǎng)基相似的增殖效率[51-52]。無血清分化培養(yǎng)基也是培養(yǎng)肉的研究重點，通過IGF-1等生長因子配制的無血清分化培養(yǎng)基幫助成肌細胞體外分化，然而效率還有待提高[53-55]。另一種商業(yè)的血清替代物UltroserG能夠幫助成肌細胞更好地分化融合為肌管[28，56-57]。然而，UltroserG含有人源蛋白，從而限制了其在培養(yǎng)肉研究中的應用。在胚胎干細胞體外分化為肌肉細胞的研究中，利用胰島素和N-2培養(yǎng)基組成的無血清培養(yǎng)基也可以誘導肌管分化[58-59]。對于培養(yǎng)肉而言，將小鼠和人的無血清研究成果轉化應用到畜禽動物細胞上，并進一步優(yōu)化到食品領域，仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。未來研究應通過轉錄組學、代謝組學（包括脂質組學、糖組學等）、蛋白組學等多組學聯用，建立肌源性細胞增殖、分化等生物學過程中的營養(yǎng)物質的攝入和廢棄物產出的“精準營養(yǎng)”調控過程，從而實現無血清培養(yǎng)基的個性化定制。另外，篩選出培養(yǎng)肉所需的生長因子等重要無血清成分后，利用生物工程技術，合成相關功能因子，從而大幅降低培養(yǎng)基成本，提高培養(yǎng)基的穩(wěn)定性[4，60]。5.4種子細胞大規(guī)模培養(yǎng)MarkPost教授第1塊85g培養(yǎng)肉漢堡約含有1.5×1010個成肌細胞，經過誘導分化生成培養(yǎng)肉組織[9]。而普通的10cm培養(yǎng)皿只能生產約1×106個細胞。如何實現工業(yè)化種子細胞生產，也是制約培養(yǎng)肉產業(yè)化的重要難題。傳統的二維培養(yǎng)因較低的表面積體積比，不能對培養(yǎng)條件進行實時監(jiān)測，傳代過程繁瑣等一系列不足而不能用于培養(yǎng)肉種子細胞的擴大培養(yǎng)。大規(guī)模培養(yǎng)通常所用的方法是微載體懸浮培養(yǎng)[61]、固定化培養(yǎng)[62]或者聚集體懸浮培養(yǎng)[63]等方法。肌肉干細胞由于貼壁培養(yǎng)以及分化過程中需要細胞融合的生物學特性，因此選擇微載體懸浮培養(yǎng)是目前較為可行的培養(yǎng)方法。微載體細胞培養(yǎng)就是使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點[64]。微載體培養(yǎng)成肌細胞過程中，高密度容易發(fā)生細胞聚集和分化現象[65]。PascaleBoudreault等[66]詳細研究了二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)現象，發(fā)現早期的流體剪切力會抑制細胞生長。SanneVerbruggen等[61]研究發(fā)現，牛的成肌細胞能用幾種商業(yè)的微載體懸浮培養(yǎng)，并且細胞可以實現在微載體上的轉移。上述研究僅針對1L以下的轉瓶條件，而在2～20L生物反應器以及更大的超過200L的生物反應器中還沒有詳細研究[60，67]。未來的研究首先應關注畜禽動物肌肉干細胞高密度培養(yǎng)下的干性維持；然后，需要優(yōu)化微載體培養(yǎng)時的種類、微載體含量、細胞接種數目、攪拌頻率等工藝參數；最后，需要設計規(guī)模200L以上的生物反應器，培養(yǎng)條件如細胞攝入氧氣的動力學參數、剪切應力對細胞的影響等也需進一步研究[67]。5.5種子細胞大規(guī)模分化形成肌管在生理狀態(tài)下，肌肉組織最終通過筋腱連接在骨骼上。通過模仿生理狀態(tài)下的肌肉，這種拉伸的組織工程模具能夠幫助肌肉細胞的排列、延伸，最終形成良好的收縮性和功能的肌肉組織[68-70]。目前用于生產肌肉組織的模具主要有單柱型、雙柱型以及多柱型[9，68]。然而，傳統的組織工程所生產的肌肉組織較小，通常應用到藥物篩選和小鼠模型研究中。如何生產較大的肌肉組織用于培養(yǎng)肉生產也成為一大難題。未來研究應聚焦于大型肌肉組織模具的開發(fā)，并研究如何大批量生產肌肉組織的方法。在生理狀態(tài)下，骨骼肌肌肉細胞在細胞外基質的包裹下有序排列，形成肌肉組織。這些細胞外基質一般包括層粘黏蛋白、膠原蛋白IV、膠原蛋白I和糖蛋白等[71-73]。在三維的肌肉組織研究中，通常用天然分離的生物材料或合成的生物材料作為細胞外基質[74]。未來的支架材料應首先利用現有的食品動物源蛋白材料（膠原蛋白、明膠等）作為支架材料，研究培養(yǎng)肉肌肉組織生產過程和工藝，作為培養(yǎng)肉的過渡生產方式[75]。然而，培養(yǎng)肉的初衷是減少動物飼養(yǎng)，要研究非動物源的生物材料，如植物源的蛋白以及多糖類大分子，通過修飾或者改性后用于肌肉組織生產[76]。另外，研究一些可生物降解的合成材料，如聚乳酸，用于培養(yǎng)肉組織生產。最后，依據生物支架材料所需的特性，利用合成生物學的方法生產，如用大腸桿菌、酵母等生產體外重組膠原蛋白等[77]。由于培養(yǎng)肉的主要目的是獲得分化的肌細胞，并大量生產肌肉蛋白，因此提高細胞的分化效率以及蛋白合成效率也是需要研究的重要課題。IGF-1/PI3K/Akt信號通路[78]，mTORC1信號通路[79]可以幫助肌細胞在體外分化并誘導肌管肥大，從而增加肌管的蛋白質合成。Insulin，IGF和Wnt7a等可以通過這些信號通路來誘導肌管肥大[80-81]。機械拉伸作用[82-83]、電刺激[84]也能進一步幫助肌管成熟。明確這些信號通路在畜禽農產動物成肌細胞分化中的作用，從而幫助培養(yǎng)肉的蛋白生產還需進一步研究。培養(yǎng)肉生產的最終目標是在體外培養(yǎng)1塊與真實肌肉組織相同的肌肉組織，因此需探索分化形成大塊肌肉組織的方法。三維結構支架+灌注式反應器是一種潛在的方式[3]。然而，經過測算，這樣的方式僅能用于幾毫米到1～2cm厚的支架，相關的生物反應器也需要進一步開發(fā)[67]。另外，現階段的3D打印技術可以實現較大塊的肌肉組織生產。KangHW等[69]利用3D打印的方式，生產出1塊（15×5×1）mm3的小鼠肌肉組織。未來可以通過混合可食用支架材料以及不同種細胞，直接3D打印肌肉組織用于培養(yǎng)肉的生產。5.6食品化技術現階段，各公司和科研機構生產的培養(yǎng)肉肌肉組織在肉特有的色、香、味、型等方面還存在不足，需要通過商品化加工和重塑成型處理，制成培養(yǎng)肉產品[85]。食品化的首要前提是了解畜禽動物的肌肉組織構成以及產品的色、香、味、型形成原因。在肌肉組織中，血紅蛋白和肌紅蛋白是肉類顏色的主要來源；脂質氧化、美拉德反應是肉品風味的重要來源；肌肉細胞內的小分子代謝產物，加工過程中大分子降解生成的一些小分子肽、氨基酸、核苷酸等是肉品滋味的主要來源；而肉品的加工特性如乳化特性、凝膠特性等都是依賴肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的作用[24，86-87]。根據色、香、味、型的形成原理，利用添加各種輔料以及培養(yǎng)肉自身的蛋白特性，制作培養(yǎng)肉產品[88]。趙鑫銳等[85]綜述了培養(yǎng)肉食品化的一些途徑，包括生物合成血紅蛋白以維持產品的色澤和風味，體外美拉德反應形成風味物質，生物合成脂肪酸等以豐富產品的色、香、味等辦法