20222022學(xué)年高中生物選修一最新同步教學(xué)2

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)課題背景尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。但尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨后才能被植物利用。細(xì)菌能利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3NH3不能直接吸收，植物吸收其中的N是以NH4和NO3-形式吸收的。NH3的水溶性高，在水中形成NH4；土壤里的微生物如硝化細(xì)菌把NH3氧化為NO3-，然后以NO3-的形式被植物吸收。常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌②統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌研究思路（一）篩選菌株（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（三）設(shè)置對照課題背景啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。PCR技術(shù)是一種常用的DNA擴(kuò)增技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)的自動(dòng)化，需要使用耐高溫的DNA聚合酶，如果請你來找這種耐高溫的酶，你會(huì)去哪里找？熱泉70-80攝氏度的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而耐熱的Taq細(xì)菌脫穎而出。水生耐熱細(xì)菌Taq（一）篩選菌株4一、研究思路1、實(shí)驗(yàn)室微生物的篩選原理人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。（一）篩選菌株2、選擇培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。加入青霉素的培養(yǎng)基——細(xì)菌不生長，酵母菌、霉菌等真菌能生長5一、研究思路（1）在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素（2）分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進(jìn)行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。3、分離尿素分解菌的選擇培養(yǎng)基（一）篩選菌株6一、研究思路1mm（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法①不能區(qū)分死菌與活菌；②不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；③個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察缺點(diǎn)7一、研究思路利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。a不能區(qū)分死菌與活菌；b不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；c需要相對高的細(xì)菌濃度；d個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；缺點(diǎn)一、研究思路（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、研究思路2、活菌計(jì)數(shù)法——統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目（稀釋涂布平板法）（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目9一、研究思路3稀釋涂布平板法在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。原理：恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。一、研究思路（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目每克樣品中的菌落數(shù)＝C÷V×MC代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積ml，M代表稀釋倍數(shù)。2稀釋涂布平板法一、研究思路（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30——300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低？注意事項(xiàng)當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。一、研究思路排除實(shí)驗(yàn)組中非測試因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。二、研究思路設(shè)置對照的主要目的是：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不同，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤或者是混入了其他的含氮物質(zhì)實(shí)例：一、研究思路（三）設(shè)置對照小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。一、研究思路（三）設(shè)置對照（一）土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（二）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于初次實(shí)驗(yàn)，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。

準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作對照）。還需要8個(gè)滅菌試管和1個(gè)滅菌移液管。

將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。（三）、樣品的稀釋二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（三）、樣品的稀釋注意：實(shí)驗(yàn)時(shí)要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。（四）、取樣涂布二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)——實(shí)驗(yàn)時(shí)要對培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)日期、稀釋度等。三、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)（四）、取樣涂布高濃度→低濃度，換槍頭低濃度→高濃度，可不用換槍頭三、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)（四）、取樣涂布三、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30—300的平板，則說明稀釋操作比較成功，可以對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。記細(xì)菌：30～37℃；1～2d霉菌：25～28℃；3～4d放線菌：25～28℃；5～7d

1培養(yǎng)：2觀察與計(jì)數(shù)：一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。記（五）、培養(yǎng)和觀察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。微生物的培養(yǎng)與觀察1、結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30——300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相近？3、你統(tǒng)計(jì)的每克土壤中含有能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？24四、結(jié)果分析與評價(jià)土樣涂布在選擇培養(yǎng)基分解尿素的細(xì)菌菌落鑒別培養(yǎng)基分解尿素的細(xì)菌鑒定分解尿素的菌體能合成脲酶，可將尿素分解為氨。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，PH升高。通過檢測培養(yǎng)基的PH變化來判斷。理解在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。記五、課題延伸在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素本課題只是對能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行了初步的篩選，只是分離純化菌種的第一步。對分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定，要借助生物化學(xué)的方法。CONH22H2OCO22NH3脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅五、課題延伸大腸桿菌呈深紫色,中心有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂EMB上典型特征【課堂小結(jié)】一、分離--選擇培養(yǎng)基的：分解尿素細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)尿素作為唯一的氮源。二、鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，pH升高，說明細(xì)菌能分解尿素。三、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法（1）顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（2）間接計(jì)數(shù)法（稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法）①計(jì)算公式每克樣品中的菌株數(shù)＝C÷V×M②操作：設(shè)置重復(fù)組，選擇菌落數(shù)30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。四、設(shè)置對照①證明培養(yǎng)基未被污染---用空白培養(yǎng)基作對照（選擇培養(yǎng)基不接種土壤樣品）。②證明選擇培養(yǎng)基的選擇作用--對照組（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種等量同種菌液）1、下列能選擇出分解尿素細(xì)菌的培養(yǎng)基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、瓊脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、瓊脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、瓊脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水1、下列能選擇出分解尿素細(xì)菌的培養(yǎng)基是AH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、尿素、瓊脂、水BH2PO4、Na2HPO4、、葡萄糖、瓊脂、水CH2PO4、Na2HPO4、、尿素、瓊脂、水DH2PO4、Na2HPO4、、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水A課后練習(xí)：2、下列是關(guān)于“檢測土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯(cuò)誤的是（）A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B取104、105、，分別涂布于各組平板上C將實(shí)驗(yàn)組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)D確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)D2、下列是關(guān)于“檢測土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯(cuò)誤的是（）A用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B取104、105、，分別涂布于各組平板上C將實(shí)驗(yàn)組和對照組平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)D確定對照組無菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)3、用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對照是A未接種的選擇培養(yǎng)基B未接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基C接種了的選擇培養(yǎng)基D接種了的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基4、在本課題的實(shí)驗(yàn)中，下列關(guān)于土壤取樣的敘述，錯(cuò)誤的是（）A土壤取樣時(shí)應(yīng)選取肥沃、濕潤的土壤左右，再取樣C取樣用的小鐵鏟和信封在使用前不用滅菌D應(yīng)在火焰旁邊稱取土壤DC課后練習(xí)：4能夠測定樣品活菌數(shù)的方法是A稀釋涂布平板法B直接計(jì)數(shù)法C重量法D比濁法5下列關(guān)于微生物分離和培養(yǎng)的敘述,錯(cuò)誤的是A微生物培養(yǎng)前,需對培養(yǎng)基進(jìn)行消毒B測定土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)目,常用菌落計(jì)數(shù)法C分離土壤中不同的微生物,要采用不同的稀釋度D分離能分解尿素的細(xì)菌,要以尿素作為培養(yǎng)基中唯一的氮源AA課后練習(xí)：6、牛等牲畜的瘤胃中生活著許多以尿素作唯一氮源的微生物。某同學(xué)從剛宰殺的牛的瘤胃中取樣獲得菌液，并對能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行分離、計(jì)數(shù)和鑒定。回答下列問題：（1