動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)

22動(dòng)物細(xì)胞工程221動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？許多動(dòng)物的細(xì)胞能夠分泌蛋白質(zhì)。但是，單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)量是很少的，怎樣才能獲得大量的分泌蛋白？一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。閱讀教材P44~45頁(yè)，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程原代培養(yǎng)：動(dòng)物組織細(xì)胞的初次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞越來(lái)越多，需要定期地用胰蛋白酶使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，這稱為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代后就不易傳下去了。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞在傳至10~50代左右時(shí)，增殖會(huì)逐漸緩慢，以至于完全停止，這時(shí)部分細(xì)胞的細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化。當(dāng)繼續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)，少部分細(xì)胞會(huì)克服細(xì)胞壽命的自然極限，獲得不死性，這些細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了突變，正在朝著等同于癌細(xì)胞的方向發(fā)展。有可能在培養(yǎng)條件下無(wú)限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常為10代以內(nèi)，以保持細(xì)胞正常的二倍體型。思考題：1進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時(shí)，胃蛋白酶就會(huì)失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pH為72～84。多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為72～74，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒(méi)有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化。2、胰蛋白酶真的不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長(zhǎng)時(shí)間的作用也會(huì)消化細(xì)胞膜蛋白，對(duì)細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時(shí)間。討論：多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)以及閱讀教材P46內(nèi)容，思考并討論以下問(wèn)題：1、體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？2、體外培養(yǎng)細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？1、體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？細(xì)胞體外培養(yǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)基本相同，需要有糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等。合成培養(yǎng)基：將細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基。由于人們對(duì)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還沒(méi)有完全搞清楚，因此，在使用合成培養(yǎng)基時(shí)，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件思考題：為什么對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)通常要添加血清？血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動(dòng)物細(xì)胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長(zhǎng)激素等及多種生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子等）；血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要保證細(xì)胞能夠順利生長(zhǎng)和增殖，一般需添加10%～20%的血清。2、體外培養(yǎng)細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境：對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行無(wú)菌處理；在培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素，以防培養(yǎng)過(guò)程中污染；定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害。溫度和PH值：細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度一般與動(dòng)物的體溫相近，哺乳動(dòng)物多以365±05℃為宜。多數(shù)細(xì)胞生存的適宜PH值為72~74。氣體環(huán)境：細(xì)胞培養(yǎng)的氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣是細(xì)胞代謝所必需，二氧化碳的主要作用是維持培養(yǎng)液的PH值。（三）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1、大規(guī)模生產(chǎn)有重要價(jià)值的生物制品。如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。2、為基因工程技術(shù)提供受體細(xì)胞。3、用培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞檢驗(yàn)有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性。4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變細(xì)胞，用于勝利、病理、藥理等方面的研究。1二、動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物閱讀教材：思考以下問(wèn)題。1、目前，是否能象植物組織培養(yǎng)技術(shù)一樣將高產(chǎn)奶牛的一個(gè)體細(xì)胞培育成一頭高產(chǎn)奶牛？為什么？2、什么是動(dòng)物核移植技術(shù)？什么動(dòng)物叫克隆動(dòng)物？3、哺乳動(dòng)物核移植包括哪幾類？哪種最難實(shí)現(xiàn)？1、目前，是否能象植物組織培養(yǎng)技術(shù)一樣將高產(chǎn)奶牛的一個(gè)體細(xì)胞培育成一頭高產(chǎn)奶牛？為什么？不能。動(dòng)物細(xì)胞的全能性會(huì)隨著動(dòng)物細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)酢?、什么是動(dòng)物核移植技術(shù)？什么動(dòng)物叫克隆動(dòng)物？動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入到一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。用核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物。3、哺乳動(dòng)物核移植包括哪幾類？哪種最難實(shí)現(xiàn)？胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植；體細(xì)胞核移植最難實(shí)現(xiàn)。（一）體細(xì)胞核移植的過(guò)程討論：1在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。3你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？克隆動(dòng)物絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來(lái)自于受體卵母細(xì)胞。所以，用教材中所述的方法克隆的動(dòng)物不是供核動(dòng)物完全相同的復(fù)制。此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動(dòng)物完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。（二）體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景閱讀教材，思考以下問(wèn)題。1、體細(xì)胞核移植技術(shù)主要應(yīng)用在哪幾個(gè)方面？2、體細(xì)胞核移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有何應(yīng)用？3、體細(xì)胞核移植技術(shù)在動(dòng)物保護(hù)方面有何應(yīng)用？4、體細(xì)胞核移植技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有何應(yīng)用？1、體細(xì)胞核移植技術(shù)主要應(yīng)用在哪幾個(gè)方面？在畜牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生，以及其他領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。2、體細(xì)胞核移植技術(shù)在畜牧業(yè)生產(chǎn)中有何應(yīng)用？利用體細(xì)胞克隆技術(shù)可以加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群的繁育。3、體細(xì)胞核移植技術(shù)在動(dòng)物保護(hù)方面有何應(yīng)用？可望利用體細(xì)胞核移植技術(shù)增加瀕危動(dòng)物的存活數(shù)量。4、體細(xì)胞核移植技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有何應(yīng)用？轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物可以作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)許多珍貴的醫(yī)用蛋白。轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物細(xì)胞、組織和器官可以作為異種移植的供體。人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)的組織、器官后，可以用于組織器官的移植。研究克隆動(dòng)物和克隆細(xì)胞可使人類更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過(guò)程。用克隆動(dòng)物做疾病模型，能使人們更好的追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程和治療疾病。（三）體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題1、利用體細(xì)胞核移植克隆動(dòng)物成功率仍然很低，產(chǎn)下的活克隆動(dòng)物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%2、克隆技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步改進(jìn)。3、絕大多數(shù)克隆動(dòng)物存在健康問(wèn)題，許多克隆動(dòng)物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過(guò)大、異常肥胖、發(fā)育困難、臟器缺陷、免疫失調(diào)等。4、對(duì)克隆動(dòng)物食品的安全性問(wèn)題也存在爭(zhēng)議。思考與探究：1幼齡與老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反。所以，一般來(lái)說(shuō)幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。2動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)脫分化的過(guò)程嗎？為什么？脫分化又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過(guò)程。植物的任何一部分，甚至單個(gè)細(xì)胞都具有長(zhǎng)成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細(xì)胞具有發(fā)育成任何組織的能力，然后進(jìn)行再分化，形成完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無(wú)病毒植株等，這就要求植物的組織或細(xì)胞先進(jìn)行脫分化。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒(méi)有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過(guò)程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。31997年，美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為308t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國(guó)高產(chǎn)奶牛場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國(guó)奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。（1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說(shuō)明理由?？梢杂皿w細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，說(shuō)明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。但同時(shí)需注意，該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克??？首先從